Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
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Este trabajo fue apoyado por el ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) a S.B. Los datos utilizados en este trabajo fueron (parcialmente) producidos a través de las instalaciones técnicas GenSeq del Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier con el apoyo de LabEx CeMEB, un programa ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01).

La configuración de este protocolo requiere un conocimiento preciso del punto de inserción, eliminación, inversión o duplicación dentro de la secuencia ancestral. Esta información generalmente se obtiene mediante secuenciación del genoma completo (WGS) de las muestras puntuales finales o intermedias. En el siguiente protocolo, se da el principio general para el caso de una mutación de inserción para cada paso, junto con un caso representativo donde se sigue la frecuencia de una inserción IS10 en el gen mutS...

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	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Aquí, hemos propuesto un método rentable que permite seguir la dinámica de los alelos SV adaptativos emergentes en poblaciones de evolución experimental. Este método combina las técnicas clásicas de PCR y la electroforesis capilar paralela automatizada, lo que permite determinar las cantidades relativas de dos alelos. Una vez configurado, permite la cuantificación de proporciones alélicas en muchas muestras en paralelo, y es mucho menos costoso que WGS. Este método puede verse como un equivalente a la secuencia...

Las variantes estructurales (SV) son alteraciones de la secuencia genómica, que generalmente afectan a 50 pb o más. Las cuatro categorías de SV descritas son inserciones grandes, eliminaciones grandes, inversiones y duplicaciones. Hasta hace poco, se ha prestado más atención a las variantes de un solo nucleótido (SNV) que a las variantes estructurales, en términos de sus efectos fenotípicos y su papel como determinantes genéticos de la enfermedad, o su contribución a la adaptación. Esto se debe probablemente a que es más fácil detectar SNV y predecir sus efectos fenotípicos. Sin embargo, las tecnologías de secuenciación profunda de lectura corta y larga han mejorado fuertemente la detección de SV, al menos en genomas individuales o clonales1. Paralelamente, se han caracterizado mejor sus efectos fenotípicos y se han documentado muchos ejemplos de su implicación como determinantes genéticos de la enfermedad humana 2,3 o adaptación a un nuevo entorno4.
Las deleciones e inserciones, a menudo debidas a inserciones de elementos genéticos móviles (MGE), son mucho más perjudiciales que los polimorfismos de nucleótido único (SNP) y conducen a mutaciones de cambio de marco y modificaciones de la estructura de las proteínas. Las deleciones e inserciones de MGE dentro de los genes casi siempre resultan en la inactivación de genes, y las inserciones en regiones no codificantes pueden conducir a la represión o expresión constitutiva de genes adyacentes cuando las secuencias de inserción (IS) contienen secuencias promotoras o de terminación5. Si bien la eliminación de genes esenciales conduce a claros efectos perjudiciales sobre la aptitud bacteriana, la pérdida de genes no esenciales es beneficiosa en algunos casos. A pesar de sus costos inherentes, las duplicaciones también pueden ser ventajosas y participar en la adaptación, ya que conducen a un cambio en la dosis de genes; Un aumento en la actividad de una proteína específica puede ser ventajoso dependiendo de las condiciones6.
Las poblaciones de evolución experimental microbiana generalmente se inician con clones. Esta ausencia inicial de diversidad genética, combinada con el "ambiente cerrado" característico de los tubos de ensayo, conduce a un potencial muy limitado de evolución por ganancia de genes a través de la transferencia horizontal de genes y la recombinación. En estas condiciones específicas, la contribución a la adaptación de deleciones, duplicaciones e inserción intragenómica de MGE es particularmente importante; Las bacterias a menudo se adaptan a través de mutaciones de pérdida de función (principalmente debido a deleciones o inserciones de MGE), afectando genes que no son útiles en ambientes artificiales de monocultivo estables, a menudo ricos en nutrientes,7. En el experimento de evolución de E. coli de más larga duración, las inserciones de IS150 son particularmente frecuentes entre las poblaciones evolucionadas después de 50.000 generaciones, con elementos IS que representan el 35% de las mutaciones que alcanzan alta frecuencia en poblaciones que conservan su tasa de mutación puntual ancestral8.
Estudios de evolución y resecuencia que combinan la evolución experimental y las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) para investigar cómo las bacterias se adaptan, a nivel fenotípico y genómico, a diferentes condiciones ambientales y tensiones, como diferentes fuentes de carbono y energía, antibióticos y estrés osmótico 9,10,11 . Estos estudios suelen obtener información genómica sobre las poblaciones evolucionadas o clones únicamente en el punto final experimental y, en algunos casos, en una serie de puntos temporales intermedios12,13,14. Estos datos proporcionan información sobre los genes y las vías involucradas en la adaptación a un entorno determinado, pero rara vez permiten a los investigadores seguir la dinámica de los alelos emergentes y amplios de novo a lo largo del tiempo.
Un enfoque para seguir estas dinámicas es elegir un número limitado de alelos segregadores de interés (debido a la función de los genes que afectan, porque barren en paralelo en poblaciones independientes, etc.) y usar la secuenciación de amplicones para cuantificar la proporción de alelos, agrupando muchos puntos de tiempo en la misma ejecución de secuenciación15. Este método se ha utilizado con éxito para seguir la dinámica de variantes de pequeño tamaño (SNPs o indeles de 1 pb) en16 poblaciones experimentales ynaturales de 17 microbios. Sin embargo, en el caso de indeles más grandes o inserciones MGE, la diferencia de tamaño de los amplicones induce diferencias en la eficiencia de PCR, que distorsionan la relación entre las proporciones de lectura y alelos. En ciertos casos, la diferencia de tamaño entre los dos alelos es superior a la longitud clásica del amplicón. Aquí, combinamos una técnica de PCR triplete con electroforesis capilar paralela automatizada para cuantificar la frecuencia relativa de un alelo de inserción basado en la discriminación de tamaño. Este enfoque permite la explotación de puntos de tiempo experimentales infrautilizados para determinar la dinámica de un alelo mutante emergente y seguir su frecuencia hasta la fijación o pérdida, de una manera rentable. Aplicamos este método para rastrear alelos mutS emergentes, mutados a través de una inserción IS10, proporcionando al genotipo mutado un fenotipo hipermutador.
Este método requiere dos alelos objetivo con una diferencia de tamaño del ≥5%. En primer lugar, los trillizos de imprimación están diseñados para producir fragmentos de tamaño similar, que comparten una imprimación común. En segundo lugar, se optimizan las condiciones de PCR y se produce una curva de calibración utilizando mezclas de gDNA de tipo salvaje (WT) y mutante. Por último, las muestras se amplifican mediante PCR, y la frecuencia relativa de cada alelo se cuantifica mediante electroforesis capilar cuantitativa paralela.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Ahora se sabe que las variantes estructurales (SV) (es decir, deleciones, inserciones, duplicaciones e inversiones) desempeñan un papel importante en la variación fenotípica y, en consecuencia, en procesos como la determinación de enfermedades o la adaptación a un nuevo entorno. Sin embargo, las variantes de un solo nucleótido reciben mucha más atención que las SV, probablemente porque son más fáciles de detectar y sus efectos fenotípicos son más fáciles de predecir. El desarrollo de tecnologías de secuenciación profunda de lectura corta y larga ha mejorado considerablemente la detección de SV, pero la cuantificación de su frecuencia a partir de datos de secuenciación agrupada (poolseq) sigue siendo técnicamente compleja y costosa.
Aquí, presentamos un método bastante simple y económico, que permite a los investigadores seguir la dinámica de la frecuencia del alelo SV. Como ejemplo de aplicación, seguimos la frecuencia de inserción de una secuencia de inserción (IS) en poblaciones de bacterias en evolución experimental. Este método se basa en el diseño de tripletes de cebadores alrededor de los bordes de la variante estructural, de modo que los amplicones producidos por la amplificación de los alelos de tipo salvaje (WT) y derivados difieren en tamaño en al menos un 5%, y que su eficiencia de amplificación es similar. La cantidad de cada amplicón se determina entonces mediante electroforesis capilar paralela y se normaliza a una curva de calibración. Este método puede extenderse fácilmente a la cuantificación de la frecuencia de otras variantes estructurales (deleciones, duplicaciones e inversiones) y a enfoques de agrupamiento de poblaciones naturales, incluidas las poblaciones de patógenos dentro de los pacientes.

Utilizando ADN extraído de un clon ancestral y un clon hipermutador aislado de la población S2.11 en la generación 1.000, establecimos la curva de calibración que se muestra en la Figura 2. Las proporciones mutantes reales de mezclas de ADN preparadas en laboratorio y medidas por el instrumento de electroforesis capilar paralela se unieron mediante una relación lineal de pendiente 1.0706, con un R2 de 0.9705. Además, hubo un buen acuerdo entre las réplicas biológicas; La d...

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Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Desarrollamos un método rentable para seguir la dinámica del alelo de polimorfismo de un solo nucleótido que puede adaptarse fácilmente a los archivos congelados de evolución experimental. Una técnica de PCR triplete se combinó con electroforesis capilar paralela automatizada para cuantificar la frecuencia relativa de un alelo de inserción en el transcurso de la evolución experimental.

Siguiendo la dinámica de variantes estructurales en poblaciones evolucionadas experimentalmente

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Las variantes estructurales como inserciones, deleciones, duplicaciones e inversiones han sido en el pasado más difíciles de seguir experimentalmente, y sus frecuencias no pueden medirse con precisión mediante la secuenciación de amplicones. Aquí proporcionamos una técnica simple y rentable, que combina triplicar el diseño del cebador y la electroféresis capilar paralela para seguir las frecuencias alélicas de variantes estructurales a lo largo del tiempo. Este método fue diseñado para complementar la secuenciación de puntos finales en la evolución experimental y para rastrear las frecuencias de alelos emergentes de novo.Esperamos que este método también beneficie a aquellos que trabajan con datos de patógenos intra huéspedes. Demostrando el procedimiento estará Jeanne Hamet, una asistente de investigación de nuestro laboratorio. Los diferentes pasos de los métodos se mostrarán en un caso en el que el alelo derivado resulta de una inserción IS10 en un gen bacteriano llamado mutS.Primero diseñe un par de cebadores para amplificar un amplicón corto en el alelo de tipo salvaje alrededor del sitio de inserción mutante. Diseñe un tercer cebador hacia adelante dos dentro de la secuencia de inserción para producir una ligera variable de tamaño del amplicón de tipo salvaje. Comience extrayendo ADN de cultivos de 24 horas de tipo salvaje fijo y clones de alelos mutantes.Después de cuantificar el ADN, diluya cada extracto de ADN a cinco nanogramos por microlitro con agua. Fije las dos muestras en una proporción de 50/50. Configure una reacción de 20 microlitros que contenga 10 nanogramos de muestra de ADN, cebadores y mezcla maestra de PCR.A continuación, separe el producto de PCR por electroforesis, utilizando un gel de agarosa al 2%. La diferencia de tamaño entre los amplicones del tipo salvaje y el mutante debe verificarse en el gel. Para obtener una curva de calibración, comience mezclando el ADN de tipo salvaje y el ADN mutante en varias proporciones.Diluir los productos de PCR a 0,1 nanogramos por concentración de microlitro. Para preparar el gel de separación, mezcle el gel fresco y el tinte. Reemplace el búfer de entrada.Coloque el tampón de enjuague en la ubicación correcta del cajón del instrumento de electroforesis capilar paralela. Agregue 22 microlitros del marcador diluyente a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Ahora agregue dos microlitros de los productos de PCR diluidos a cada pocillo de muestra.A un pozo, agregue una escalera de tamaño de ADN de un kit de alta sensibilidad, que va de uno a 6, 000 pares de bases de tamaño. Coloque la microplaca en el instrumento de electroforesis capilar paralela en una ejecución seleccionada en el software del instrumento. Analice los resultados utilizando el software de análisis de datos.Primero, identifique los picos en función de su tamaño conocido. Cuantifique cada amplicón para producir una curva de calibración. Finalmente, verifique que las cantidades relativas de los dos alelos se midan correctamente.Esta curva de calibración se utiliza para calcular la cantidad de variantes estructurales después de la amplificación por PCR y la electroforesis capilar paralela. Estos resultados representativos siguen una inserción disruptiva en el gen mutS. Los knockdowns y mutS conducen a un fenotipo hipermutador, lo que permite a las bacterias muestrear más mutaciones que su tasa de mutación base.Utilizando el método presentado, se rastreó la frecuencia de la variante estructural mutS a través de 1000 generaciones. Se reveló una trayectoria no monótona del alelo mutante emergente. El alelo mutante se detectó por primera vez en la generación 680.El alelo aumentó rápidamente en frecuencia, alcanzando el 67% en la generación 713. Este aumento luego se estancó, aumentando solo un 10% en las siguientes 53 generaciones, a 76% Inesperadamente, la frecuencia de alelos mutantes disminuyó del 76% al 49% en el transcurso de 13 generaciones, después de lo cual aumentó a la fijación. Este método beneficiará a aquellos que trabajan en la evolución experimental.Este protocolo permite al usuario tomar archivos congelados y explorar trayectorias evolutivas que de otro modo no serían observables con los datos de secuenciación de puntos finales.

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Investigación

Biología

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

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The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

El método de cultivo de la rebanada por Siguiendo desarrollo de gérmenes de dientes en Explante Cultura

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Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...