Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) till S.B. Data som användes i detta arbete producerades (delvis) genom GenSeqs tekniska anläggningar vid Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier med stöd av LabEx CeMEB, ett ANR "Investissements d'avenir" -program (ANR-10-LABX-04-01).

Att ställa in detta protokoll kräver exakt kunskap om infognings-, raderings-, inversions- eller dupliceringspunkten inom förfädernas sekvens. Denna information erhålls vanligtvis genom helgenomsekvensering (WGS) av slut- eller intermediärpunktproverna. I följande protokoll ges den allmänna principen för en insättningsmutation för varje steg, tillsammans med ett representativt fall där frekvensen för en IS10-insättning i mutS-genen i en experimentell evolutionspopulation av E. coli följs . </e...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Här har vi föreslagit en kostnadseffektiv metod som gör det möjligt att följa dynamiken hos framväxande adaptiva SV-alleler i experimentella evolutionspopulationer. Denna metod kombinerar klassiska PCR-tekniker och automatiserad parallell kapillärelektrofores, vilket gör det möjligt att bestämma de relativa kvantiteterna av två alleler. När den väl har ställts in tillåter den kvantifiering av allelproportioner i många prover parallellt och är mycket billigare än WGS. Denna metod kan ses som en motsvarig...

Strukturella varianter (SV) är förändringar av den genomiska sekvensen, som i allmänhet påverkar 50 bp eller mer. De fyra kategorierna av beskrivna SV är stora infogningar, stora borttagningar, inversioner och dubbletter. Fram till nyligen har mer uppmärksamhet ägnats åt enkelnukleotidvarianter (SNV) än åt strukturella varianter, när det gäller deras fenotypiska effekter och deras roll som genetiska determinanter för sjukdom, eller deras bidrag till anpassning. Detta beror förmodligen på att det är lättare att både upptäcka SNV och förutsäga deras fenotypiska effekter. Kort- och långlästa djupsekvenseringstekniker har dock kraftigt förbättrat detektionen av SV, åtminstone i enskilda enskilda eller klonala genom1. Parallellt har deras fenotypiska effekter karakteriserats bättre, och många exempel på deras implikation som genetiska determinanter för mänsklig sjukdom 2,3 eller anpassning till en ny miljö4 har dokumenterats.
Deletioner och insättningar, ofta på grund av insättning av mobila genetiska element (MGE), är mycket mer störande än enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP) och leder till ramförskjutningsmutationer och proteinstrukturmodifieringar. Deletioner och MGE-infogningar inom gener resulterar nästan alltid i geninaktivering, och infogningar i icke-kodande regioner kan leda till förtryck eller konstitutivt uttryck av intilliggande gener när insättningssekvenser (IS) innehåller promotor- eller avslutningssekvenser5. Medan knockout av väsentliga gener leder till tydliga skadliga effekter på bakteriell kondition, är förlusten av icke-väsentliga gener fördelaktig i vissa fall. Trots deras inneboende kostnader kan dubbelarbete också vara fördelaktigt och delta i anpassning eftersom de leder till en förändring av gendoseringen. En ökning av aktiviteten hos ett specifikt protein kan vara fördelaktigt beroende på förhållandena6.
Mikrobiella experimentella evolutionspopulationer startas vanligtvis med kloner. Denna initiala frånvaro av genetisk mångfald, i kombination med den "slutna miljön" som är karakteristisk för provrör, leder till en mycket begränsad potential för evolution genom genförstärkning genom horisontell genöverföring och rekombination. Under dessa specifika förhållanden är bidraget till anpassning av deletioner, dupliceringar och intragenomisk MGE-insättning särskilt viktigt. bakterier anpassar sig ofta genom funktionsförlustmutationer (främst på grund av deletioner eller MGE-insättningar), vilket påverkar gener som inte är användbara i stabila, ofta näringsrika, monokulturella konstgjorda miljöer7. I det längsta E. coli-evolutionsexperimentet är IS150-insättningar särskilt frekventa bland populationer som utvecklats efter 50 000 generationer, med IS-element som representerar 35% av mutationerna som når hög frekvens i populationer som behåller sin förfäders punktmutationshastighet8.
Utveckla och omsekvensera studier koppla experimentell evolution och nästa generations sekvenseringsteknik (NGS) för att undersöka hur bakterier anpassar sig, på fenotypiska och genomiska nivåer, till olika miljöförhållanden och påfrestningar, såsom olika kol- och energikällor, antibiotika och osmotisk stress 9,10,11 . Dessa studier erhåller vanligtvis genomisk information om de utvecklade populationerna eller klonerna enbart vid experimentets slutpunkt, och i vissa fall vid ett antal mellanliggande tidpunkter12,13,14. Dessa data ger insikt i gener och vägar som är involverade i anpassningen till en given miljö, men tillåter sällan forskare att följa dynamiken hos de novo framväxande och svepande alleler över tiden.
Ett tillvägagångssätt för att följa denna dynamik är att välja ett begränsat antal segregerande alleler av intresse (på grund av funktionen hos de gener de påverkar, eftersom de sveper parallellt i oberoende populationer etc.) och använda amplikonsekvensering för att kvantifiera allelproportionen, samla många tidpunkter i samma sekvenseringskörning15. Denna metod har framgångsrikt använts för att följa dynamiken hos små varianter (SNP eller 1 bp indels) i experimentella16 och naturliga17 populationer av mikrober. När det gäller större indels eller MGE-infogningar inducerar emellertid storleksskillnaden mellan ampliconerna PCR-effektivitetsskillnader, vilket snedvrider förhållandet mellan läs- och allelproportioner. I vissa fall är storleksskillnaden mellan de två allelerna överlägsen ampliconens klassiska längd. Här kopplade vi en triplett-PCR-teknik med automatiserad parallellkapillärelektrofores för att kvantifiera den relativa frekvensen av en insättningsallel baserat på storleksdiskriminering. Detta tillvägagångssätt möjliggör utnyttjande av underutnyttjade experimentella tidpunkter för att bestämma dynamiken hos en framväxande mutant allel och följa dess frekvens till fixering eller förlust på ett kostnadseffektivt sätt. Vi tillämpade denna metod för att spåra nya mutS-alleler, muterade genom en IS10-insättning, vilket gav den muterade genotypen en hypermutatorfenotyp.
Denna metod kräver två målalleler med en skillnad på ≥5% i storlek. För det första är primertripletter utformade för att producera fragment av liknande storlek, som delar en gemensam primer. För det andra optimeras PCR-förhållandena och en kalibreringskurva produceras med hjälp av blandningar av vildtyp (WT) och muterat gDNA. Slutligen amplifieras proverna med PCR, och den relativa frekvensen för varje allel kvantifieras genom parallell kvantitativ kapillärelektrofores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Strukturella varianter (SV) (dvs. deletioner, infogningar, duplikationer och inversioner) är nu kända för att spela en viktig roll i fenotypisk variation och följaktligen i processer som sjukdomsbestämning eller anpassning till en ny miljö. Enstaka nukleotidvarianter får dock mycket mer uppmärksamhet än SV, förmodligen för att de är lättare att upptäcka och deras fenotypiska effekter är lättare att förutsäga. Utvecklingen av kort- och långlästa djupsekvenseringstekniker har avsevärt förbättrat detekteringen av SV, men kvantifieringen av deras frekvens från poolade sekvenseringsdata (poolseq) är fortfarande tekniskt komplex och dyr.
Här presenterar vi en ganska enkel och billig metod som gör det möjligt för forskare att följa dynamiken i SV-allelfrekvensen. Som ett exempel på tillämpning följer vi frekvensen av en insättningssekvens (IS) insättning i experimentella evolutionspopulationer av bakterier. Denna metod är baserad på utformningen av tripletter av primrar runt de strukturella variantgränserna, så att amplikonerna som produceras genom amplifiering av vildtypen (WT) och härledda alleler skiljer sig åt i storlek med minst 5%, och att deras förstärkningseffektivitet är likartad. Mängden av varje amplikon bestäms sedan genom parallell kapillärelektrofores och normaliseras till en kalibreringskurva. Denna metod kan enkelt utvidgas till kvantifiering av frekvensen av andra strukturella varianter (deletioner, dupliceringar och inversioner) och till pool-seq-metoder för naturliga populationer, inklusive patogenpopulationer inom patienter.

Med hjälp av DNA extraherat från en förfäderklon och en hypermutatorklon isolerad från S2.11-populationen vid generation 1,000 fastställde vi kalibreringskurvan som visas i figur 2. De faktiska mutanta proportionerna från laboratorieberedda DNA-blandningar och mätta med instrumentet för parallellkapillärelektrofores var kopplade av ett linjärt förhållande av lutning 1,0706, med enR2 på 0,9705. Dessutom fanns det en bra överensstämmelse mellan biologiska replikat; S...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Vi utvecklade en kostnadseffektiv metod för att följa alleldynamik för icke-singelnukleotidpolymorfism som enkelt kan anpassas till experimentell evolution, frysta arkiv. En triplett-PCR-teknik kopplades till automatiserad parallellkapillärelektrofores för att kvantifiera den relativa frekvensen av en insättningsalel under experimentell utveckling.

Följa dynamiken hos strukturella varianter i experimentellt utvecklade populationer

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Strukturella varianter som infogningar, borttagningar, duplikationer och inversioner har tidigare varit svårare att följa experimentellt, och deras frekvenser kan inte mätas exakt med amplikonsekvensering. Här tillhandahåller vi en enkel kostnadseffektiv teknik, som kopplar ihop trippelprimerdesign och parallell kapillärelektroferes för att följa strukturella variantallelfrekvenser över tid. Denna metod utformades för att komplettera slutpunktssekvensering i experimentell evolution och för att spåra frekvenserna av framväxande de novo-alleler.Vi hoppas att denna metod också kommer att gynna dem som arbetar med patogendata inom värdar. Jeanne Hamet, forskningsassistent från vårt laboratorium, demonstrerar förfarandet. De olika stegen i metoderna kommer att visas i ett fall där den härledda allelen är resultatet av en IS10-insättning i en bakteriegen som kallas mutS.Designa först ett par primers för att förstärka en kort amplikon på allelen av vildtyp runt mutantinsättningsstället. Designa en tredje primer framåt primer två inom införingssekvensen för att producera en liten storleksvariabel från den vilda typen amplikon. Börja med att extrahera DNA från 24-timmarskulturer av fast vildtyp och mutanta allelkloner.Efter kvantifiering av DNA, späd varje DNA-extrakt till fem nanogram per mikroliter med vatten. Fixa de två proverna i ett 50/50-förhållande. Ställ in en 20-mikroliters reaktion innehållande 10 nanogram DNA-prov, primers och PCR-masterblandning.Därefter separera PCR-produkten genom elektrofores med en 2% agarosgel. Storleksskillnaden mellan amplikonerna från den vilda typen och mutanten måste verifieras på gelén. För att få en kalibreringskurva, börja med att blanda vildtyp-DNA och muterat DNA i olika förhållanden.Späd PCR-produkterna till 0,1 nanogram per mikroliterkoncentration. För att förbereda separationsgelen, blanda den färska gelén och färgämnet. Byt ut inloppsbufferten.Placera sköljbufferten i rätt lådplacering för instrumentet för parallellkapillärelektrofores. Tillsätt 22 mikroliter spädningsmarkör till brunnarna på en 96-brunnsplatta. Tillsätt nu två mikroliter av de utspädda PCR-produkterna till varje provbrunn.Till en Tja, lägg till en DNA-storleksstege från ett högkänslighetssats, som sträcker sig från ett till 6 000 baspar i storlek. Placera mikroplattan i instrumentet för parallell kapillärelektrofores i välj körning på instrumentprogramvaran. Analysera resultaten med hjälp av dataanalysprogramvaran.Identifiera först topparna baserat på deras kända storlek. Kvantifiera varje amplikon för att få fram en kalibreringskurva. Kontrollera slutligen att de relativa kvantiteterna av de två allelerna är korrekt uppmätta.Denna kalibreringskurva används sedan för att beräkna mängden strukturella varianter efter PCR-amplifiering och parallell kapillärelektrofores. Dessa representativa resultat följer en störande insättning i mutS-genen. Knockdowns och mutS leder till en hypermutatorfenotyp, vilket gör att bakterier kan prova fler mutationer än deras basmutationshastighet.Med hjälp av den presenterade metoden spårades mutS strukturella variantfrekvens över 1000 generationer. En icke-monotonisk bana för den framväxande mutanta allelen avslöjades. Den muterade allelen detekterades först vid generation 680.Allelen ökade sedan snabbt i frekvens och nådde 67% vid generation 713. Denna ökning stagnerade sedan och ökade endast 10% under de kommande 53 generationerna till 76%Oväntat minskade mutantallelfrekvensen sedan från 76% till 49% under 13 generationer, varefter den ökade till fixering. Denna metod kommer att gynna dem som arbetar med experimentell evolution.Detta protokoll gör det möjligt för användaren att ta frysta arkiv och utforska evolutionära banor som annars inte kan observeras med slutpunktssekvenseringsdata.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Intervju: HIV-1 proviral DNA Excision Använda en Evolved Recombinase

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Utvärdering av den geografiska fördelningen av γH2AX efter joniserande strålning

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Isolera förstärkas Hsp104 Varianter Använda Jäst Proteinopathy modeller

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Högupplöst time-lapse avbildning och automatiserad analys av mikrotubuli Dynamics i Living Human navelsträngsvenendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Studerar ribonucleotid införlivande: Strand-detektering av ribonukleotider i jäst genomet och mäta ribonucleotid-inducerad mutagenes

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell Imaging att bedöma dynamiken i metafas timing och cell öde efter mitotiska spindel Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...