Name: following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Bu çalışma ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) tarafından S.B.'ye desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan veriler, bir ANR "Investissements d'avenir" programı olan LabEx CeMEB'in (ANR-10-LABX-04-01) desteğiyle Institut des Sciences de l'Evolution de Montpellier'in GenSeq teknik tesisleri aracılığıyla (kısmen) üretilmiştir.

Bu protokolün kurulması, atasal dizi içindeki ekleme, silme, ters çevirme veya çoğaltma noktası hakkında kesin bilgi gerektirir. Bu bilgi genellikle uç veya ara nokta örneklerinin tüm genom dizilimi (WGS) ile elde edilir. Aşağıdaki protokolde, her adım için bir yerleştirme mutasyonu vakası için genel prensip, deneysel bir E. coli popülasyonunda mutS genindeki bir IS10 yerleştirme sıklığının izlendiği temsili bir vaka ile birlikte verilmiştir. Bu popülasyonda, uç nokta popü...

<ol>
	<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variant+calling:+the+long+and+the+short+of+it.">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246 (2019).</li><li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1.">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li><li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer.">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846 (2014).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence.">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li><li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability.">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li><li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria.">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li><li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature.">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li><li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria.">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980 (2021).</li><li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer.">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects.">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li><li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2,000+generations.">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li><li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50,000-generation+experiment.">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li><li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution.">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li><li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways.">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635 (2015).</li><li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking.">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li><li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution.">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar.">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8 (2019).</li><li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer.">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li><li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutators,+population+size,+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria.">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li></ol>

Burada, deneysel evrim popülasyonlarında ortaya çıkan adaptif SV alellerinin dinamiklerinin izlenmesini sağlayan uygun maliyetli bir yöntem önerdik. Bu yöntem, klasik PCR tekniklerini ve otomatik paralel kılcal elektroforezi birleştirerek, iki alelin göreceli miktarlarının belirlenmesini sağlar. Bir kez kurulduktan sonra, birçok numunedeki alel oranlarının paralel olarak ölçülmesine izin verir ve WGS'den çok daha ucuzdur. Bu yöntem, SNP dışı mutasyonlar için amplikon dizilemesine eşdeğer ve b?...

Yapısal varyantlar (SV'ler), genellikle 50 bp veya daha fazlasını etkileyen genomik sekansın değişiklikleridir. Açıklanan SV'lerin dört kategorisi büyük eklemeler, büyük silmeler, ters çevirmeler ve çoğaltmalardır. Yakın zamana kadar, tek nükleotid varyantlarına (SNV'ler), fenotipik etkileri ve hastalığın genetik belirleyicileri olarak rolleri veya adaptasyona katkıları açısından yapısal varyantlardan daha fazla dikkat çekilmiştir. Bunun nedeni muhtemelen SNV'leri tespit etmenin ve fenotipik etkilerini tahmin etmenin daha kolay olmasıdır. Bununla birlikte, kısa ve uzun okunan derin dizileme teknolojileri, en azından tek bir bireyde veya klonal genomlardaSV'lerin tespitini güçlü bir şekilde geliştirmiştir 1. Buna paralel olarak, fenotipik etkileri daha iyi karakterize edilmiş ve insan hastalığının genetik belirleyicileri 2,3 veya yeni bir çevreye adaptasyon4 olarak ima edildiklerine dair birçok örnek belgelenmiştir.
Genellikle mobil genetik element (MGE) yerleştirmelerine bağlı olarak delesyonlar ve eklemeler, tek nükleotid polimorfizmlerinden (SNP'ler) çok daha yıkıcıdır ve çerçeve kayması mutasyonlarına ve protein yapısı modifikasyonlarına yol açar. Genlerdeki delesyonlar ve MGE yerleştirmeleri hemen hemen her zaman gen inaktivasyonu ile sonuçlanır ve kodlamayan bölgelere yapılan eklemeler, ekleme dizileri (IS'ler) promotör veya sonlandırma dizileriiçerdiğinde bitişik genlerin baskılanmasına veya kurucu ekspresyonuna yol açabilir 5. Esansiyel genlerin nakavtlanması, bakteriyel uygunluk üzerinde açık zararlı etkilere yol açarken, esansiyel olmayan genlerin kaybı bazı durumlarda faydalıdır. Doğal maliyetlerine rağmen, duplikasyonlar da avantajlı olabilir ve gen dozajında bir değişikliğe yol açtıkları için adaptasyona katılabilirler; Belirli bir proteinin aktivitesindeki bir artış, koşullara bağlı olarak avantajlı olabilir6.
Mikrobiyal deneysel evrim popülasyonları genellikle klonlarla başlar. Genetik çeşitliliğin bu başlangıçtaki yokluğu, test tüplerinin "kapalı çevre" özelliği ile birleştiğinde, yatay gen transferi ve rekombinasyonu yoluyla gen kazanımı yoluyla çok sınırlı bir evrim potansiyeline yol açar. Bu spesifik koşullarda, delesyonların, duplikasyonların ve intragenomik MGE yerleştirilmesinin adaptasyonuna katkısı özellikle önemlidir; bakteriler genellikle fonksiyon kaybı mutasyonları yoluyla adapte olurlar (esas olarak delesyonlar veya MGE eklemeleri nedeniyle), kararlı, genellikle besin açısından zengin, monokültür yapay ortamlarda yararlı olmayan genleri etkiler7. En uzun süredir devam eden E. coli evrim deneyinde, IS150 yerleştirmeleri, 50.000 kuşaktan sonra evrimleşen popülasyonlar arasında özellikle sık görülür ve IS elementleri, atalarının nokta mutasyon oranını koruyan popülasyonlarda yüksek frekansa ulaşan mutasyonların% 35'ini temsil eder8.
Bakterilerin fenotipik ve genomik seviyelerde, farklı karbon ve enerji kaynakları, antibiyotikler ve ozmotik stres gibi farklı çevresel koşullara ve streslere nasıl adapte olduklarını araştırmak için deneysel evrimi ve yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerini birleştiren evrimleşme ve yeniden sıralama çalışmaları 9,10,11 . Bu çalışmalar tipik olarak evrimleşmiş popülasyonlar veya klonlar hakkında genomik bilgiyi yalnızca deneysel bitiş noktasında ve bazı durumlarda 12,13,14 numaralı ara zaman noktalarında elde eder. Bu veriler, belirli bir ortama adaptasyonda yer alan genler ve yollar hakkında fikir verir, ancak nadiren araştırmacıların zaman içinde ortaya çıkan ve süpürülen de novo alellerin dinamiklerini takip etmelerine izin verir.
Bu dinamikleri takip etmek için bir yaklaşım, sınırlı sayıda ayırıcı alel seçmek (etkiledikleri genlerin işlevi nedeniyle, bağımsız popülasyonlarda paralel olarak süpürüldükleri için, vb.) ve alel oranını ölçmek için amplikon dizilimini kullanmak, aynı dizileme koşusunda birçok zaman noktasını bir araya getirmektir15. Bu yöntem, deneysel16 ve doğal17 mikrop popülasyonunda küçük boyutlu varyantların (SNP'ler veya 1 bp indel) dinamiklerini takip etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, daha büyük indeller veya MGE yerleştirmeleri durumunda, amplikonların boyut farkı, okuma ve alel oranları arasındaki ilişkiyi bozan PCR verimlilik farklılıklarını indükler. Bazı durumlarda, iki alel arasındaki boyut farkı, amplikonun klasik uzunluğundan daha üstündür. Burada, boyut ayrımına dayalı bir yerleştirme alelinin göreceli frekansını ölçmek için üçlü bir PCR tekniğini otomatik paralel kılcal elektroforez ile birleştirdik. Bu yaklaşım, ortaya çıkan bir mutant alelin dinamiklerini belirlemek ve fiksasyon veya kayıp sıklığını uygun maliyetli bir şekilde takip etmek için az kullanılan deneysel zaman noktalarının kullanılmasına izin verir. Bu yöntemi, bir IS10 yerleştirme yoluyla mutasyona uğramış ve mutasyona uğramış genotipe hipermutator bir fenotip sağlayan ortaya çıkan mutS- alellerini izlemek için uyguladık.
Bu yöntem, boyut olarak% ≥5'lik bir farka sahip iki hedef alel gerektirir. İlk olarak, astar üçlüleri, ortak bir astarı paylaşan benzer büyüklükteki parçalar üretmek üzere tasarlanmıştır. İkincisi, PCR koşulları optimize edilir ve vahşi tip (WT) ve mutant gDNA karışımları kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi üretilir. Son olarak, örnekler PCR ile güçlendirilir ve her alelin göreceli frekansı paralel kantitatif kılcal elektroforez ile ölçülür.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Skirted PCR Plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4Ti - 0740</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose molecular biology grade</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td>EP-0010-05</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit Quick Guide for the Fragment Analyzer Systems</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>PDF instruction guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TBE</td>
			<td>Panreac appliChem</td>
			<td>A4228,5000Pc</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated Disposable Inoculating Loops and Needles</td>
			<td>LABELIANS</td>
			<td>8175CSR40H</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Blood and Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Amilabo</td>
			<td>ST606T</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment Analyzer Automated CE System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fragment DNA Ladder</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-396, range 1-6000bp</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1264-1G</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity diluent marker</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-373</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity NGS quantitative analysis kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DNF-474</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder quick load 1 kb plus DNA ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0469S</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>28713</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F548L</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Eurogentec</td>
			<td></td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prosize data analysis software v.4</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>V.4</td>
			<td>Parallel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assays</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MAN0010876</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Ep gradients</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVbox, eBOX VX5</td>
			<td>Vilber Lourmat</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis visualisation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for injectable preparation</td>
			<td>Aguettant</td>
			<td>PROAMP</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

following the dynamics of structural variants in experimentally evolved populations

Yapısal varyantların (SV'ler) (yani, silmeler, eklemeler, duplikasyonlar ve inversiyonlar) artık fenotipik varyasyonda ve dolayısıyla hastalık belirleme veya yeni bir ortama adaptasyon gibi süreçlerde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bununla birlikte, tek nükleotid varyantları SV'lerden çok daha fazla dikkat çekmektedir, çünkü muhtemelen tespit edilmeleri daha kolaydır ve fenotipik etkilerinin tahmin edilmesi daha kolaydır. Kısa ve uzun okunan derin dizileme teknolojilerinin geliştirilmesi, SV'lerin algılanmasını güçlü bir şekilde geliştirmiştir, ancak havuzlanmış sıralama (poolseq) verilerinden frekanslarının ölçülmesi hala teknik olarak karmaşık ve pahalıdır.
Burada, araştırmacıların SV alel frekansının dinamiklerini takip etmelerini sağlayan oldukça basit ve ucuz bir yöntem sunuyoruz. Bir uygulama örneği olarak, bakterilerin deneysel evrim popülasyonlarında bir ekleme dizisi (IS) ekleme sıklığını takip ediyoruz. Bu yöntem, yapısal varyant sınırlarının etrafındaki primer üçlülerinin tasarımına dayanır, böylece vahşi tip (WT) ve türetilmiş alellerin amplifikasyonu ile üretilen amplikonların boyut olarak en az% 5 oranında farklılık göstermesi ve amplifikasyon verimliliklerinin benzer olması gerekir. Her amplikonun miktarı daha sonra paralel kılcal elektroforez ile belirlenir ve bir kalibrasyon eğrisine normalleştirilir. Bu yöntem, diğer yapısal varyantların (delesyonlar, duplikasyonlar ve inversiyonlar) sıklığının nicelleştirilmesine ve hasta içi patojen popülasyonları da dahil olmak üzere doğal popülasyonların havuz-seq yaklaşımlarına kolayca genişletilebilir.

Bir atasal klondan ekstrakte edilen DNA'yı ve 1000. nesildeki S2.11 popülasyonundan izole edilen bir hipermutatör klonu kullanarak, Şekil 2'de gösterilen kalibrasyon eğrisini belirledik. Laboratuvarda hazırlanan DNA karışımlarından elde edilen ve paralel kılcal elektroforez cihazı ile ölçülen gerçek mutant oranlar, 0.9705'lik bir R2 ile 1.0706 eğiminin doğrusal bir ilişkisi ile bağlandı. Ek olarak, biyolojik replikalar arasında iyi bir anlaşma vardı; Stand...

Watch this Scientific Journal Video about Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations at JoVE.com

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

Deneysel evrim dondurulmuş arşivlerine kolayca uyarlanabilen tek nükleotid olmayan polimorfizm alel dinamiklerini takip etmek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Üçlü PCR tekniği, deneysel evrim boyunca bir yerleştirme alelinin göreceli frekansını ölçmek için otomatik paralel kılcal elektroforez ile birleştirildi.

Deneysel Olarak Evrimleşmiş Popülasyonlarda Yapısal Varyantların Dinamiklerini Takip Etmek

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

Eklemeler, silmeler, çoğaltmalar ve ters çevirmeler gibi yapısal değişkenlerin geçmişte deneysel olarak takip edilmesi daha zordu ve frekansları amplikon dizilimi ile doğru bir şekilde ölçülemedi. Burada, zaman içinde yapısal varyant alel frekanslarını takip etmek için primer tasarımını ve paralel kılcal elektrofereziyi üçe katlayan basit bir uygun maliyetli teknik sunuyoruz. Bu yöntem, deneysel evrimde son nokta dizilimini tamamlamak ve ortaya çıkan de novo alellerin frekanslarını izlemek için tasarlanmıştır.Bu yöntemin, konak içi patojen verileriyle çalışanlara da fayda sağlayacağını umuyoruz. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma görevlisi olan Jeanne Hamet olacaktır. Yöntemlerin farklı adımları, türetilmiş alelin mutS adı verilen bir bakteri genindeki IS10 yerleştirmesinden kaynaklandığı bir durumda gösterilecektir.İlk olarak, mutant yerleştirme bölgesi etrafındaki vahşi tip alel üzerinde kısa bir amplikonu büyütmek için bir çift primer tasarlayın. Vahşi tip amplikondan hafif bir boyut değişkeni üretmek için yerleştirme sırası içinde üçüncü bir astar ileri astar iki tasarlayın. Sabit vahşi tip ve mutant alel klonlarının 24 saatlik kültürlerinden DNA çıkararak başlayın.DNA'yı ölçtükten sonra, her DNA ekstraktını mikrolitre başına beş nanograma kadar su ile seyreltin. İki örneği 50/50 oranında sabitleyin. 10 nanogram DNA örneği, primerler ve PCR ana karışımı içeren 20 mikrolitrelik bir reaksiyon ayarlayın.Daha sonra,% 2'lik bir agaroz jeli kullanarak PCR ürününü elektroforez ile ayırın. Yabani tipteki amplikonlar ile mutant arasındaki boyut farkı, jel üzerinde doğrulanmalıdır. Bir kalibrasyon eğrisi elde etmek için, vahşi tip DNA ve mutant DNA'yı çeşitli oranlarda karıştırarak başlayın.PCR ürünlerini mikrolitre konsantrasyon başına 0.1 nanograma seyreltin. Ayırma jelini hazırlamak için, taze jeli ve boyayı karıştırın. Giriş arabelleğini yerine takın.Durulama tamponunu paralel kılcal elektroforez cihazının doğru çekmece konumuna yerleştirin. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına 22 mikrolitre seyreltici işaretleyici ekleyin. Şimdi her numuneye seyreltilmiş PCR ürünlerinin iki mikrolitresini ekleyin.Bir kuyuya, yüksek hassasiyetli bir kitten, bir ila 6.000 baz çifti arasında değişen bir DNA boyutu merdiveni ekleyin. Mikroplakayı paralel kılcal elektroforez cihazına, cihaz yazılımındaki seçili çalıştırmada yerleştirin. Veri analiz yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin.İlk olarak, zirveleri bilinen boyutlarına göre tanımlayın. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için her amplikonu sayın. Son olarak, iki alelin göreceli miktarlarının doğru şekilde ölçüldüğünden emin olun.Bu kalibrasyon eğrisi daha sonra PCR amplifikasyonu ve paralel kılcal elektroforez sonrası yapısal varyantların miktarını hesaplamak için kullanılır. Bu temsili sonuçlar, mutS geninde yıkıcı bir eklemeyi takip eder. Nakavtlar ve mutS, hiper mutator fenotipe yol açarak, bakterilerin baz mutasyon oranlarından daha fazla mutasyon örneklemesine izin verir.Sunulan yöntem kullanılarak, mutS yapısal varyant frekansı 1000 nesil boyunca izlendi. Ortaya çıkan mutant alelin monotonik olmayan bir yörüngesi ortaya çıktı. Mutant alel ilk olarak 680. nesilde tespit edildi.Alel daha sonra frekansta hızla arttı ve 713 kuşağı tarafından% 67'ye ulaştı. Bu artış daha sonra durgunlaştı, sonraki 53 nesil boyunca sadece% 10 artarak% 76'ya yükseldi Beklenmedik bir şekilde, mutant alel frekansı daha sonra 13 nesil boyunca% 76'dan% 49'a düştü ve daha sonra fiksasyona yükseldi. Bu yöntem, deneysel evrim üzerinde çalışanlara fayda sağlayacaktır.Bu protokol, kullanıcının dondurulmuş arşivleri almasına ve uç nokta sıralama verileriyle gözlemlenemeyen evrimsel yörüngeleri keşfetmesine olanak tanır.

Research

JoVE Journal

Biology

Interview: HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase

Röportaj: Evolved Recombinase kullanarak HIV-1 Proviral DNA eksizyonu

HIV-1 integrates into the host chromosome of infected cells and persists as a provirus flanked by long terminal repeats. Current treatment strategies ...

Biyoloji

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Tek Hücre Popülasyonlar Yüksek Kalite RNA Alınması

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...