Name: in vivo gene delivery into mouse mammary epithelial cells through mammary intraductal injection
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00
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Agradecemos al Dr. Gary Chamness por sus útiles comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa (DOD) CDMRP BC191649 (YL) y BC191646 (YL), así como los Institutos Nacionales de Salud (NIH) CA271498 (YL). Los autores desean agradecer a la Instalación Central de Patología del Centro de Mama respaldada por SPORE P50CA186784, y al Núcleo de Citometría y Clasificación Celular respaldado por CPRIT-RP180672, NIH CA125123 y RR024574 con la ayuda de Joel M. Sederstrom.

Todos los procedimientos con ratones se realizaron de acuerdo con el protocolo animal aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Para el presente estudio, se utilizaron ratones hembra FVB / N o MMTV-tva de 9-12 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron comercialmente o de fabricación propia (ver Tabla de materiales). Se utilizaron los virus Lenti-EGFP (FUCGW) y RCAS-Erbb2 (Neu). La preparación del virus y la determinación del título se realizaron ...

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+ATM-mediated+barrier+to+tumorigenesis+in+somatic+mammary+cells+following+ErbB2+activation.">Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER/PR-negative+mouse+mammary+tumors.">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li><li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer.">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li><li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies.">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li><li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2.">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).</li><li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype.">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li><li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress.">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li><li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer.">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).</li><li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR/Cas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland.">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li></ol>

Este artículo demuestra la técnica de inyección intraductal viral para introducir genes en células epiteliales mamarias de ratón para modelar el cáncer de mama esporádico. Por lo general, se inyectan ratones de al menos 5 semanas o más para que el proceso oncogénico comience después de que se desarrolle la glándula mamaria. Además, la abertura del pezón de ratones menores de 5 semanas de edad es a menudo demasiado pequeña para la inyección. Por otro lado, los pezones de ratones muy viejos a veces se degene...

Las células epiteliales de las glándulas mamarias juegan un papel importante en la función de estas glándulas y son la principal célula de origen del cáncer de mama. Los estudios de la biología de las glándulas mamarias y la tumorigénesis con frecuencia necesitan la entrega de genes de interés en estas células. Cada glándula mamaria de ratón comprende un árbol ductal revestido por células epiteliales con una sola abertura en la punta del pezón. Esta estructura hace que las células epiteliales mamarias sean fácilmente accesibles para los vectores virales, que pueden ser entregados en la luz de un árbol ductal a través de la inyección intraductal1.
La técnica de inyección intraductal mamaria se utilizó originalmente para animales mucho más grandes como cabras, conejos y ratas1. Para un animal mucho más pequeño como los ratones, la inyección intraductal necesita muchas herramientas delicadas y más prácticas de los operadores. Existen dos enfoques para la inyección intraductal en ratones. Una es la inyección hasta la tetina1. Otra es la inyección directa del conducto primario de la glándula mamaria #3 o #4 después de la exposición quirúrgica1. Dado que la primera es no invasiva y más rápida una vez que el operador ha sido bien entrenado, esta técnica se usa más comúnmente y se describirá en detalle en este artículo.
En comparación con los modelos tradicionales de ratón transgénico ampliamente utilizados, en los que el gen de interés se introduce en la etapa de óvulos fertilizados a través de microinyección 2,3,4, la administración de genes a través del método de inyección intraductal de virus tiene muchas ventajas, que incluyen: (1) evita el proceso lento de hacer una línea de ratón transgénico para cada gen de interés; (2) evita el deterioro potencial en el desarrollo normal de las glándulas mamarias impuesto por el gen de interés; (3) introduce el gen de interés en cualquier momento deseado después del nacimiento; (4) puede cointroducir fácilmente más de un gen de interés; (5) imita mejor el proceso tumorigénico natural porque las células infectadas y, por lo tanto, portadoras de oncogenes están rodeadas por células normales; y (6) en combinación con la tecnología TVA (virus tumoral A, una proteína de la superficie celular aviar y el receptor para el vector RCAS del retrovirus)5, el gen de interés puede introducirse en una población celular específica para estudiar el origen celular de la tumorigénesis y realizar ensayos de rastreo del linaje celular en las glándulas mamarias 6,7,8, 9.
Cualquier vector derivado del retrovirus 10, lentivirus 11,12, adenovirus 13 y virus asociado a adenovirus (AAV)14 puede utilizarse para la administración intraductal de materiales genéticos. Los vectores de retrovirus y lentivirus se integran en el genoma del huésped de forma permanente; Por lo tanto, introducen genes de interés de manera estable en las células epiteliales mamarias. Mientras que el lentivirus puede integrarse en el genoma de cualquier célula que encuentre15, la integración genómica eficiente del retrovirus necesita la proliferación de las células diana16. Los vectores adenovirales y AAV no se integran en el genoma de las células infectadas y, por lo tanto, sólo expresan transitoriamente el gen de interés17,18. Esta característica puede ser una ventaja cuando el gen de interés necesita expresarse solo por un corto período de tiempo, como Cre, para eliminar un gen supresor de tumores floxed.
Lentivirus, adenovirus y AAV infectan cualquier célula de ratón que encuentren. Pero dado que el epitelio luminal está aislado en gran medida de la capa basal subyacente, que está más separada del estroma por la membrana basal, la inyección intraductal limita la infección en gran medida a las células epiteliales luminales, la célula primaria de origen del cáncer de mama. Dentro de esta capa epitelial luminal, también hay distintos subtipos de células, incluidas las células madre, las células progenitoras y varios grupos de células diferenciadas. Para infectar subconjuntos celulares específicos dentro de la población de células luminales, se puede utilizar la tecnología TVA, con la que los vectores RCAS 5,10 derivados del virus de la leucosis aviar o los vectores lentivirales pseudotipados11 infectan selectivamente las células que expresan TVA en ratones que portan un transgén tva bajo el control de un promotor específico del tipo celular, como un promotor que está activo solo en células madre 6 o ciertos progenitores 6, 7 o células alveolares8 o células activas de la vía Wnt9.
Este protocolo presenta la técnica de introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias mediante inyección intraductal de un vector viral. A continuación, se demuestra la detección de la expresión de los genes introducidos y las lesiones hiperplásicas y tumores resultantes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-101P</td>
			<td>Dilution: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Tears</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>NDC 11695-0832-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525</td>
			<td>microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCantoII</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>V96100899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCGW lenti-virus</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See reference # 12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB/N</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>91033</td>
			<td>autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>201000</td>
			<td>autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED magnifying lamp</td>
			<td>Intertek</td>
			<td>3165273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro dissection spring scissor</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5621</td>
			<td>autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MMTV-tva</td>
			<td>Self-made</td>
			<td></td>
			<td>See reference # 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCAS-Neu (HA)</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See reference # 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Comboanesthetic III</td>
			<td>Veterinary Pharmacy</td>
			<td>Veterinary prescription</td>
			<td>37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo gene delivery into mouse mammary epithelial cells through mammary intraductal injection

Las glándulas mamarias del ratón comprenden árboles ductales, que están revestidos por células epiteliales y tienen una abertura en la punta de cada pezón. Las células epiteliales juegan un papel importante en la función de la glándula mamaria y son el origen de la mayoría de los tumores mamarios. La introducción de genes de interés en células epiteliales mamarias de ratón es un paso crítico en la evaluación de la función génica en las células epiteliales y la generación de modelos de tumores mamarios de ratón. Este objetivo se puede lograr a través de la inyección intraductal de un vector viral que lleva los genes de interés en el árbol ductal mamario del ratón. El virus inyectado posteriormente infecta las células epiteliales mamarias, trayendo los genes de interés. El vector viral puede ser lentiviral, retroviral, adenoviral o viral asociado a adenovirus (AAV). Este estudio demuestra cómo un gen de interés se administra en las células epiteliales mamarias a través de la inyección intraductal mamaria de ratón de un vector viral. Un lentivirus portador de GFP se utiliza para mostrar la expresión estable de un gen entregado, y un retrovirus portador de Erbb2 (HER2/Neu) se utiliza para demostrar lesiones hiperplásicas atípicas inducidas por oncogén y tumores mamarios.

Aquí se presentan datos representativos para demostrar el éxito de la inyección intraductal, la infección viral exitosa y el impacto de los genes entregados en la tumorigénesis mamaria. La cantidad de virus inyectado debe adaptarse al propósito de cada experimento. Para ilustrar cuán extensamente se puede infectar el árbol del conducto mamario, se debe usar una gran cantidad de genes portadores de virus que se pueden visualizar, como GFP. Por otro lado, para imitar la tumorigénesis espontánea natural, se debe u...

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In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

El presente protocolo describe la inyección intraductal de vectores virales a través de la tetina para administrar genes de interés en las células epiteliales mamarias.

In vivo Entrega de genes en células epiteliales mamarias de ratón a través de inyección intraductal mamaria

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Este método entrega el material genético en las células epiteliales de la glándula mamaria de una manera especial, temporal y cuantitativamente controlable. Dado que la entrega de material genético en las células epiteliales mamarias es especial, temporal y cuantitativamente controlada, los modelos mamarios generados por este método imitan mejor la génesis natural del tumor. Comience la preparación de la jeringa cortando las agujas metálicas de calibre 33 a aproximadamente un centímetro de largo y almacenándolas en alcohol.Retire las jeringas y agujas del alcohol y expulse el alcohol restante de la jeringa y las agujas. Luego desmonte la jeringa para secar al aire. Después del secado, ensamble la jeringa.Saque los tubos de stock viral del congelador de menos 80 grados centígrados y descongélelos en hielo. Para añadir azul de bromofenol, sumerja la punta de la pipeta a una profundidad de un centímetro en el polvo azul de bromofenol. Luego lleve la traza adjunta de azul de bromofenol a la suspensión del virus.Mezcle el azul de bromofenol con la solución de virus pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces, antes de colocar el virus en hielo. Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie de un ratón hembra anestesiado. Aplique ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras el animal está bajo anestesia.Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla caliente y fije las cuatro extremidades al banco con cinta adhesiva. Identifique el pezón que se inyectará y expóngalo recortando el vello circundante con tijeras. Aplique 70% de alcohol y cuatro hisopos en tres rondas alternas en el área del pezón para limpiar y exponer el pezón.Transecto la punta distal de un pezón con un par de tijeras de resorte de microdisección esterilizadas, hasta que se pueda ver una pequeña abertura ductal central debajo de una lámpara de lupa. Luego cargue 10 microlitros de la mezcla de azul de bromofenol del virus en la jeringa e inserte cuidadosamente la aguja en la abertura del pezón con la ayuda de la lámpara de la lupa. Inyecte los 10 microlitros completos del virus en el árbol de conductos y coloque el ratón en un calentador de diapositivas ajustado a 45 grados centígrados hasta que el ratón se despierte por completo.Abra la cavidad torácica de tres a cinco días después de la inyección del virus. Corte la piel a lo largo de la línea media ventral y las extremidades superiores e inferiores con tijeras. Levante la piel y exponga las glándulas mamarias.Retire la glándula mamaria inyectada de la piel y una glándula no inyectada como control con fórceps y tijeras. Una vez hecho esto, coloque la glándula mamaria en un portaobjetos de vidrio y extienda la glándula a su forma original antes de observarla y obtener imágenes bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. El éxito de la inyección intraductal se confirmó al exponer la glándula mamaria y observar un árbol ductal azul.Después de dos a cinco días de la inyección del virus lenti-EGFPFUCGW, la infección de células epiteliales mamarias se evaluó observando toda la preparación del monte bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Para el análisis de citometría de flujo de las proteínas fluorescentes o marcadores de superficie celular producidos por el virus, las glándulas no infectadas y las glándulas infectadas se recolectaron y procesaron en una suspensión de una sola célula para estimar la tasa de infección viral. El ERBBB2 activado provocó lesiones precancerosas en unas pocas semanas y tumores en unos pocos meses.El tamaño de los pezones puede variar significativamente debido a las diferencias en masa, edad, peso corporal y fuerza entre los ratones individuales. Recortar adecuadamente la punta del pezón para exponer la abertura del conducto mamario y el ajuste de la aguja es un paso importante para inyectar con éxito el virus.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Procedimientos quirúrgicos y metodología para un modelo murino preclínico<em&gt; De Novo</em&gt; Metástasis del cáncer mamario

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Modeling Breast Cancer via an Intraductal Injection of Cre-expressing Adenovirus into the Mouse Mammary Gland

Modelar el cáncer de mama a través de una inyección intraductal de Adenovirus C-expreso en la Glándula Mamaria del Ratón

Breast cancer is a heterogeneous disease, possibly due to complex interactions between different cells of origins and oncogenic events. Mouse models are ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Intraductal Delivery and X-ray Visualization of Ethanol-Based Ablative Solution for Prevention and Local Treatment of Breast Cancer in Mouse Models

Administración intraductal y visualización por rayos X de la solución ablativa a base de etanol para la prevención y el tratamiento local del cáncer de mama en modelos de ratón

Breast cancer is the most prevalent cancer and the second-leading cause of cancer-related death for women in the USA. For high-risk women, prophylactic ...