Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

نشكر جورج واتاس وجوزي كلوني على المناقشات خلال المراحل الأولى من تطوير البروتوكول. تم دعم العمل بأموال من المعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم R35GM133737 إلى SY) ، وزمالة Alfred P. Sloan (إلى S. Y.) وجائزة McKnight Scholar (إلى S. Y.).

1. تصميم وبناء كواشف تحرير الجينات
ملاحظة: لإجراء وضع العلامات الداخلية ، من الضروري تحديد الأشكال المتماثلة المختلفة للجين المطلوب. اعتمادا على الأهداف المحددة للتجربة ، يمكن دمج علامة الفلورسنت إما داخليا أو في N- أو C-termini لشكل (أشكال) البروتين المختارة. للحصول على التحرير ا...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

تظهر النتائج استراتيجية مبسطة وبسيطة من خطوة واحدة تعتمد على كريسبر لوضع علامات على الجينات الداخلية في ذبابة الفاكهة. في البروتوكول ، نستخدم اثنين من gRNAs لتحفيز كسر الشريط المزدوج للحمض النووي وإعادة التركيب المتماثل بشكل أكثر كفاءة. يتم حقن gRNAs والبلازميد المتبرع في أجنة ذبابة الف?...

ظهرت البروتينات الفلورية كأدوات قوية لتصور توطين البروتين وديناميكياته وتفاعلات البروتين والبروتين في الخلايا داخل الكائنات الحية 1,2. يتيح وضع علامات على الجينات الداخلية باستخدام البروتينات الفلورية التصوير الحي طويل المدى للعمليات الخلوية بدقة دون خلوية. علاوة على ذلك ، فإن تقنيات وضع العلامات الجينية الداخلية هذه لها العديد من المزايا مقارنة بنهج الإفراط في التعبير والمناعة المناعية. على سبيل المثال ، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن البروتينات إلى اختلال البروتين ، والتفاعلات غير المحددة بين البروتين والبروتين ، وسوء التوطين3. حتى الآن ، تمكن الباحثون من إنشاء مكتبات واسعة من الجينات الداخلية المنصهرة في البروتينات الفلورية لعدد قليل من الكائنات الحية النموذجية ، مثل الخميرة الناشئة ، والتي يمكن أن تخضع لإعادة التركيب المتماثل الفعال4. في حالة ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، تم ابتكار أدوات مختلفة مثل MiMICs5 ، ومصائد المحسن القائمة على الترانسبوزون6 ، والحفريات7 لوضع علامات على الجينات الفلورية.
أتاح تطوير الأدوات المستندة إلى CRISPR-Cas9 إجراء تحرير الجينوم بكفاءة ، بما في ذلك وضع علامات على البروتينات الداخلية ، في مجموعة واسعة من الكائنات الحيةالنموذجية 8,9. Cas9 هو إنزيم موجه بالحمض النووي الريبي يشق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بطريقة عالية الكفاءةومحددة 8 ، والتي يمكن إصلاحها بعد ذلك عن طريق مسار ربط نهاية غير متماثل (NHEJ) يؤدي إلى طفرات نقطية أو حذف. بدلا من ذلك ، يسمح مسار الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) بدمج الحمض النووي غير المتجانس في الكروموسوم.
اعتمدت الطرق السابقة لوضع العلامات الجينية القائمة على كريسبر في الكائن الحي النموذجي ، ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، على عملية من خطوتين10،11،12. يتضمن ذلك استخدام علامة لون العين المميزة ، Dsred ، لاكتشاف أحداث HDR الناجحة. بعد ذلك ، سيتم استئصال علامة Dsred باستخدام نظام إعادة التركيب Cre / loxP. لتبسيط هذه العملية وتسريعها ، نقدم هنا طريقة أبسط وأكثر كفاءة. يتحايل هذا النهج على الحاجة إلى التنميط الجيني القاتل ويسمح بالفحص المباشر للذباب الفردي. على وجه التحديد ، نستخدم نهجا قائما على تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستخراج الحمض النووي من جزء صغير من الساق الوسطى للذبابة ، مما يسمح لنا بالتنميط الجيني للذباب الفردي. والجدير بالذكر أن هذا الإجراء لا يضر بالحيوية أو الحركة أو القدرات الإنجابية للذبابة التي تم أخذ عينات منها. فقط الأفراد المناسبين ، الذين تم تحديدهم من خلال هذه الطريقة ، يتم تطويرهم إلى مخزونات مستقرة.
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتوليد الذباب الموسوم بالبروتين الفلوري حيث يتم تمييز الجينات الداخلية بمراسلي الفلورسنت. تستخدم هذه التقنية تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 لدمج أي علامة فلوروفور مرغوبة مع الطرف N أو C للجين الداخلي. أدناه ، نصف تصميم وبناء بلازميدات gRNA والبلازميد المتبرع ، واستراتيجية الفحص من خطوة واحدة لاختيار الذباب الإيجابي لكريسبر ، وخطوات إنشاء خطوط مستقرة. على وجه التحديد ، نصف استراتيجيات لوضع علامة على جين ذبابة الفاكهة الأساسي الداخلي ، الدورة ، مع فلوروفور في المحطة C. كما نصف بإيجاز تجارب التحكم التي يجب إجراؤها للتأكد من أن البروتين الموسوم هو تقنيات وظيفية وتصوير حية لتصور بروتين الدورة الشهرية في الخلايا العصبية الحية على مدار الساعة داخل أدمغة ذبابة الفاكهة السليمة 13. ينطبق البروتوكول الموصوف هنا أيضا على نطاق واسع على فحص المرشحين لحذف وإدخال أجزاء معينة من الحمض النووي عن طريق تحرير الجينوم CRISPR-Cas9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

لقد تحولت دراسة توطين البروتين تحت الخلوي وديناميكياته وتنظيمه في الخلايا الحية بشكل عميق من خلال ظهور التقنيات التي تسمح بوضع علامات على الجينات الداخلية لإنتاج بروتينات الاندماج الفلورية. تمكن هذه الطرق الباحثين من تصور سلوك البروتين في الوقت الفعلي ، مما يوفر رؤى قيمة حول وظائفهم وتفاعلاتهم داخل البيئة الخلوية. تستخدم العديد من دراسات وضع العلامات الجينية الحالية عملية من خطوتين حيث يتم استخدام العلامات المرئية ، مثل تغيرات لون العين ، لتحديد الكائنات المعدلة وراثيا في الخطوة الأولى ، ويتم استئصال العلامة المرئية في الخطوة الثانية. هنا ، نقدم بروتوكولا من خطوة واحدة لإجراء علامات جينية داخلية دقيقة وسريعة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، والتي تتيح فحص الخطوط المهندسة بدون علامة العين المرئية ، مما يوفر ميزة كبيرة على الطرق السابقة. للكشف عن أحداث وضع العلامات الجينية الناجحة ، نستخدم تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للنمط الجيني للذباب الفردي من خلال تحليل جزء صغير من ساقه الوسطى. ثم يتم استخدام الذباب الذي يجتاز معايير الفحص لإنتاج مخزونات مستقرة. هنا ، نوضح بالتفصيل تصميم وبناء بلازميدات تحرير كريسبر وطرق فحص وتأكيد الخطوط الهندسية. يعمل هذا البروتوكول معا على تحسين كفاءة وضع العلامات الجينية الداخلية في ذبابة الفاكهة بشكل كبير ويتيح دراسات العمليات الخلوية في الجسم الحي.

في تجاربنا ، وجدنا عادة معدل نجاح ~ 20٪ -30٪ في فحص مختلف الجينات الموسومة الداخلية على جميع الكروموسومات (X ، II ، III). يمكن أن تختلف كفاءة هذه العملية بناء على عدة عوامل ، مثل اختيار gRNA وطبيعة الجين وجودة الحقن. هنا ، نوضح نتائج استراتيجيتنا لوضع علامة على جين الفترة الداخ...

Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

هنا ، نقدم بروتوكولا مبسطا لوضع علامات على الجينات الداخلية لذبابة الفاكهة ، والذي يستخدم تقنية قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد التعديلات الجينية الناجحة بدون علامات ، مما يسهل تطوير خطوط طرق ثابتة.

استراتيجية قائمة على كريسبر بخطوة واحدة لوضع العلامات الجينية الداخلية في ذبابة الفاكهة الميلانية

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

الغرض من هذا البروتوكول هو إنشاء خط ذبابة محرر داخلي. نعرض ضربة قاضية للبروتين الفلوري كمثال ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على طرق أخرى ، وضربة قاضية ، وكذلك توليد طفرة. بروتوكولنا هو طريقة تعتمد على إعادة التركيب المتماثل كريسبر ، لذلك لا يوجد أي قيود تقريبا على مواقع الطفرات.علاوة على ذلك ، قلل بروتوكولنا بشكل كبير من الوقت والجهد المبذولين في خطوات التنميط الجيني. للبدء ، افتح موقع CRISPR لتصميم sgRNAs لذبابة الفاكهة ، وأدخل ما يقرب من 100 تسلسل زوج أساسي يحيط بموقع الضربة القاضية المطلوب. حدد أهداف كريسبر مع خيار الجوانين الخمسة الرئيسي.انقر فوق الزر "البحث عن أهداف كريسبر" لإنشاء قائمة بتسلسلات sgRNA المحتملة. ثم انقر فوق الزر "تقييم" لكل تسلسل ، واختر اثنين من sgRNAs التي لا تحتوي على أي أهداف خارج الأهداف. نظرا لأن مستويات تعبير البروتين الطبيعي عادة ما تكون أقل بكثير ، حدد علامات الفلورسنت الساطعة والقابلة للضوء ، وتناسب الإعداد التجريبي.بعد ذلك ، صمم رابطا لربط علامات الحواتم بعلامة الفلورسنت للتحليل الكيميائي الحيوي. استخدم ببتيد رابط يتراوح من اثنين إلى 20 من الأحماض الأمينية ، بما في ذلك الأحماض الأمينية مثل الجلايسين والسيرين. لتصميم ناقل المتبرع لذبابة الفاكهة ، قم بتنظيم تسلسل الحمض النووي للببتيد الرابط وعلامة الفلورسنت ، وتأكد من تسلسلات متماثلة تحيط بكلا الطرفين.قم بتعديل أي تسلسلات PAM داخل بلازميد المتبرع للحفاظ على تسلسل الأحماض الأمينية للبروتينات الناتجة. بعد ذلك، ضع كودونات البداية والإيقاف بناء على موقع العلامة. لوضع العلامات الداخلية ، تأكد من أن علامة الفلورسنت في إطار مع تسلسل الترميز للجين المستهدف.لوضع علامات N-terminus ، ضع علامة الفلورسنت بعد كودون البدء الداخلي. لوضع علامات C-terminus ، ضع علامة الفلورسنت قبل كودون التوقف الطبيعي. تأكد من الاحتفاظ بكودون بدء واحد فقط لتجنب مشكلات الترجمة المحتملة.استخدم نهج الاستنساخ البديل القائم على الإنزيم لإدخال تسلسل sgRNA في بلازميد البلازميد U6 Bbs1-chiRNA. بعد إنشاء بلازميد sgRNA ، قم بتحويل البلازميد إلى DH5-Alpha Escherichia coli وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحقق من النسخ الناتجة من خلال تسلسل سانجر ، باستخدام إما بادئات التسلسل القياسية T3 أو T7.لإنشاء البلازميد المانح ، استخدم الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بالتسلسل المطلوب ، وقم بدمجه في موقع الاستنساخ المتعدد السلبي Bluesript 2SK البلازميد. تسلسل البلازميد المتبرع لضمان تعديل تسلسل sgRNA أو PAM بشكل صحيح وعدم وجود SNPs في البلازميد. بعد ذلك ، خذ ذباب Cas9 المحقون بالحمض النووي الريبي المبني والبلازميدات المانحة.تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون ، وفصل ذكور الذباب والإناث البكر. لإنشاء صلبان ذبابة ، قم بإقران كل ذكر G zero مع اثنين على الأقل من الإناث البكر FM7L في قوارير طعام CT ضيقة فردية. ضع قوارير متقاطعة في حاضنة مهواة يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60٪ حتى تطير F1.ثم تخدير وجمع ما لا يقل عن 10 ذرية عذراء من كل من الصلبان الذكور والإناث G صفر. تأكد من تمييز كل ذبابة F1 بتفاصيل نسبها وتخزينها بشكل منفصل. لفحص الذباب بحثا عن تفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم مواد أولية بدرجة حرارة انصهار تبلغ حوالي 55 درجة مئوية تشمل موقع تحرير الجين المستهدف.قم بإعداد مخزن التحلل المؤقت لكل عينة ذبابة ، وقم بتوزيع 10 ميكرولتر في كل بئر من لوحة PCR 96 بئرا. حافظ على المخزن المؤقت عند درجة حرارة باردة أثناء عملية تشريح الساق. بعد ذلك ، قم بإعداد أنابيب شعرية زجاجية ، وملء أحد طرفيها بطعام أجار السكروز.ضع هذه الأنابيب في لوحة بئر عميقة 96 بئرا ، يشار إليها باسم فندق الذبابة. لتشريح الساق ، ضع وسادة تخدير ثاني أكسيد الكربون تحت مجهر ستيريو. تخدير ذبابة مرشحة ، وقطع إحدى ساقيها الوسطى.بعد ذلك ، اغمر الساق في المخزن المؤقت للتحلل. امسك جناح الذبابة بزوج من الملقط المعدني الناعم. انقل الذبابة إلى فندق الذبابة ، وأغلق الأنبوب بالخيوط على الفور.ضع فندق الذبابة في حاضنة تهوية يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية ورطوبة 60٪. اغمر الأرجل المقطوعة في محلول التحلل العازل في جهاز تدوير حراري. قم بتنظيم تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، باستخدام 1.5 ميكرولتر من محلول ساق الذبابة كمصدر للحمض النووي.إخضاع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، وتفسير النتائج بناء على حجم الشريط. بناء على نتائج الهلام ، حدد الذباب الإيجابي من فندق الذباب وعبوره بشكل فردي مع ذباب الموازن لإنتاج جيل F2. استخدم مخزونا متماثل الزيجوت لتسلسل سانجر لموقع التحرير لضمان الدقة.خطوط ذبابة متقاطعة تم التحقق من صحتها مع ذباب من النوع البري لإزالة طفرات الخلفية. فحص كل جيل باستخدام بروتوكول PCR أحادي الساق. أظهرت صور المجهر متحد البؤر لأدمغة ذبابة الفاكهة البالغة بروتين الدورة الشهرية منظما في بؤر نووية سرية طوال وقت متأخر من الليل ونقاط الصباح الباكر.بشكل عام ، يكون هذا البروتوكول قويا إذا كانت بادئات التنميط الجيني PCR محددة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

تحديد العفوي الحركي آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

الفحص مباشرة للالكمي لتجنب الاجتماعي في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

الظروف التي تؤثر في الفضاء الاجتماعي<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

عالية الدقة الكمي للسلوك رائحة الموجهة في<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; استخدام<em&gt; Flywalk</em&gt; بارادايم

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

النسخ في والسلوكية الفحص لMechanosensation من MARCM المستندة<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

تستخدم علفا بروتوكول مسار طول ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

الشعيرات الدموية المغذية الفحص يقيس كمية الطعام في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

تحليل متشابك التحوير من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء بعد التعرض للضوء لفترات طويلة

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...