Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Vi takker George Watase og Josie Clowney for diskussionerne i de indledende faser af protokoludviklingen. Arbejdet blev støttet af midler fra NIH (bevilling nr. R35GM133737 til S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (til S. Y.) og McKnight Scholar Award (til S. Y.).

1. Design og konstruktion af genredigeringsreagenser
BEMÆRK: For at udføre endogen mærkning er det vigtigt at identificere de forskellige isoformer af det ønskede gen. Afhængigt af forsøgets specifikke mål kan et fluorescerende mærke inkorporeres enten internt eller ved N- eller C-termini for den eller de valgte proteinisoformer. For optimal CRISPR-medieret redigering er det afgørende at placere de to sgRNA'er passende tæt på det tilsigtede knock-in-sted. For at muliggøre redigering ...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

Resultaterne demonstrerer en strømlinet, enkel et-trins CRISPR-baseret strategi til mærkning af endogene gener i Drosophila. I protokollen bruger vi to gRNA'er til at inducere DNA-dobbeltstrengsbrud og homolog rekombination mere effektivt. GRNA'erne og donorplasmidet injiceres i bananflueembryoner, som udtrykker Cas9-enzym i deres kimlinje. Disse embryoner dyrkes derefter under standardbetingelser indtil voksenalderen, hvorefter de krydses med balancefluer for at producere den første generation (F1) afkom. PC...

Fluorescerende proteiner er opstået som kraftfulde værktøjer til visualisering af proteinlokalisering, dynamik og protein-proteininteraktioner i celler i levende organismer 1,2. Mærkning af endogene gener med fluorescerende proteiner muliggør langsigtet levende billeddannelse af cellulære processer med subcellulær opløsning. Desuden har disse endogene genmærkningsteknikker flere fordele sammenlignet med overekspression og immunfarvningsmetoder. For eksempel kan overekspression af proteiner føre til proteinfejlfoldning, uspecifikke protein-proteininteraktioner og fejllokalisering3. Hidtil har forskere været i stand til at skabe store biblioteker af endogene gener smeltet sammen med fluorescerende proteiner til nogle få modelorganismer, såsom spirende gær, som kan gennemgå effektiv homolog rekombination4. I tilfælde af Drosophila melanogaster er forskellige værktøjer såsom MiMICs5, transposonbaserede forstærkerfælder6 og fosmids7 blevet udtænkt til fluorescerende tagge gener.
Udviklingen af CRISPR-Cas9-baserede værktøjer har gjort det muligt effektivt at udføre genomredigering, herunder mærkning af endogene proteiner, i en lang række modelorganismer 8,9. Cas9 er et RNA-guidet enzym, der spalter dobbeltstrenget DNA på en yderst effektiv og specifik måde8, som derefter kan repareres af en ikke-homolog endeforbindelsesvej (NHEJ), der fører til punktmutationer eller deletioner. Alternativt tillader den homologistyrede reparationsvej (HDR) integration af heterologt DNA i kromosomet.
Tidligere metoder til CRISPR-baseret genmærkning i modelorganismen, Drosophila melanogaster, har været baseret på en totrinsproces 10,11,12. Dette indebærer at bruge en mærkbar øjenfarvemarkør, Dsred, til at registrere vellykkede HDR-hændelser. Derefter ville Dsred-markøren blive udskåret ved hjælp af Cre/loxP-rekombinationssystemet. For at strømline og fremskynde denne proces præsenterer vi her en enklere og mere effektiv metode. Denne tilgang omgår behovet for dødelig genotypebestemmelse og giver mulighed for direkte screening af individuelle fluer. Specifikt anvender vi en PCR-baseret tilgang til at udtrække DNA fra et lille segment af fluens mellemben, så vi kan genotypee individuelle fluer. Navnlig kompromitterer denne procedure ikke vitaliteten, bevægelsen eller reproduktionsevnen hos den udtagne flue. Kun de relevante individer, der identificeres ved hjælp af denne metode, videreudvikles til stabile bestande.
Her præsenterer vi en detaljeret protokol til generering af fluorescerende proteinmærkede fluer, hvor endogene gener er mærket med fluorescerende reportere. Denne teknik bruger CRISPR-Cas9 genomredigering til at smelte ethvert ønsket fluoroformærke til N- eller C-terminalen af et endogent gen. Nedenfor beskriver vi design og konstruktion af gRNA-plasmider og et donorplasmid, et-trins screeningsstrategi for at vælge CRISPR-positive fluer og trin til etablering af stabile linjer. Specifikt beskriver vi strategier til at mærke et endogent kerneur Drosophila-gen, periode, med en fluorofor ved C-terminalen. Vi beskriver også kort de kontroleksperimenter, der skal udføres for at bekræfte, at det mærkede protein er funktionelt og live-imaging teknikker til at visualisere periodeproteinet i levende urneuroner i intakte Drosophila-hjerner 13. Protokollen beskrevet her er også bredt anvendelig til screening af kandidater til sletninger og indsættelser af specifikke bits DNA ved CRISPR-Cas9 genomredigering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

Undersøgelsen af subcellulær lokalisering, dynamik og regulering af proteiner i levende celler er blevet dybt transformeret af fremkomsten af teknikker, der tillader mærkning af endogene gener til at producere fluorescerende fusionsproteiner. Disse metoder gør det muligt for forskere at visualisere proteinadfærd i realtid, hvilket giver værdifuld indsigt i deres funktioner og interaktioner i det cellulære miljø. Mange nuværende genmærkningsundersøgelser anvender en totrinsproces, hvor synlige markører, såsom øjenfarveændringer, bruges til at identificere genetisk modificerede organismer i det første trin, og den synlige markør udskæres i det andet trin. Her præsenterer vi en et-trins protokol til at udføre præcis og hurtig endogen genmærkning i Drosophila melanogaster, som muliggør screening for konstruerede linjer uden den synlige øjenmarkør, hvilket giver en betydelig fordel i forhold til tidligere metoder. For at screene for vellykkede genmærkningshændelser anvender vi en PCR-baseret teknik til at genotypee individuelle fluer ved at analysere et lille segment fra deres mellemben. Fluer, der opfylder screeningskriterierne, bruges derefter til at producere stabile bestande. Her beskriver vi design og konstruktion af CRISPR-redigeringsplasmider og metoder til screening og bekræftelse af konstruerede linjer. Sammen forbedrer denne protokol effektiviteten af endogen genmærkning i Drosophila betydeligt og muliggør undersøgelser af cellulære processer in vivo.

I vores eksperimenter fandt vi typisk en succesrate på ~ 20% -30% i screening for forskellige endogene mærkede gener på alle kromosomer (X, II, III). Effektiviteten af denne proces kan variere baseret på flere faktorer, såsom gRNA-selektion, genets art og injektionskvalitet. Her illustrerer vi resultaterne fra vores strategi om at mærke det endogene menstruationsgen med mNeonGreen fluorofor13. Periodegenet , der er placeret på X-kromosomet ...

Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Her præsenterer vi en forenklet endogen genmærkningsprotokol for Drosophila, som anvender en PCR-baseret teknik til markørfri identifikation af vellykkede genetiske modifikationer, hvilket letter udviklingen af stabile knock-in-linjer.

Et-trins CRISPR-baseret strategi for endogen genmærkning i Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Formålet med denne protokol er at generere en endogen redigeret fluelinje. Vi viser et fluorescerende protein knock-in som et eksempel, men det kan også anvendes til andre knock-in, knockout samt mutationsgenerering. Vores protokol er en CRISPR homolog rekombinationsbaseret metode, så der er næsten ingen begrænsning på mutationssteder.Desuden reducerede vores protokol i høj grad den tid og kræfter, der var involveret i genotypetrin. For at begynde skal du åbne fly CRISPR-webstedet for at designe sgRNA'er til Drosophila og indtaste ca. 100 baseparsekvenser omkring den ønskede knock-in-placering. Vælg CRISPR-mål med indstillingen fem primære guaniner.Klik på knappen find CRISPR-mål for at generere en liste over mulige sgRNA-sekvenser. Klik derefter på knappen Evaluer for hver sekvens, og vælg to sgRNA'er, der har nul off-targets. Da de naturlige proteinekspressionsniveauer typisk er meget lavere, skal du vælge fluorescerende tags, der er lyse og fototable, og som passer til den eksperimentelle opsætning.Design derefter en linker til at linke epitopmærker til fluorescerende markør til biokemisk analyse. Brug et linkerpeptid, der spænder fra to til 20 aminosyrer, der omfatter aminosyrer som glycin og serin. For at designe donorvektoren til Drosophila skal du organisere DNA-sekvensen af linkerpeptidet og det fluorescerende mærke og sikre homologe sekvenser, der flankerer begge ender.Eventuelle PAM-sekvenser i donorplasmidet ændres for at opretholde den resulterende aminosyresekvens for proteiner. Placer derefter start- og stopkodonerne afhængigt af tagplaceringen. For intern mærkning skal du sikre dig, at det fluorescerende mærke er i ramme med målgenets kodningssekvens.For N-terminus-mærkning skal du placere det fluorescerende mærke efter det endogene startkodon. Til C-terminusmærkning skal du placere det fluorescerende mærke før det naturlige stopkodon. Sørg for kun at beholde et enkelt startkodon for at undgå potentielle oversættelsesproblemer.Brug den alternative restriktionsenzymbaserede kloningsmetode til at indsætte sgRNA-sekvensen i plasmidet U6 Bbs1-chiRNA-plasmid. Efter oprettelse af sgRNA-plasmidet transformeres plasmidet i DH5-Alpha Escherichia coli i henhold til producentens anvisninger. Kontroller de resulterende kloner gennem Sanger-sekventering ved hjælp af enten T3- eller T7-standardsekventeringsprimere.For at skabe donorplasmidet skal du bruge dobbeltstrenget DNA med den ønskede sekvens og integrere det i plasmidet Bluesript 2SK negativt multipelt kloningssted. Sekvenser donorplasmidet for at sikre, at sgRNA- eller PAM-sekvenser er korrekt modificeret, og at der ikke er nogen SNP'er til stede i plasmidet. Tag derefter Cas9 fluer injiceret med de konstruerede gRNA og donorplasmider.Bedøv fluerne med kuldioxid, og adskil hanfluer og jomfruelige hunner. For at etablere fluekryds skal du parre hver G nul han med mindst to FM7L jomfruhunner i individuelle smalle CT-madhætteglas. Placer krydsede hætteglas i en ventileret inkubator, der holdes ved 25 grader Celsius og 60% fugtighed, indtil F1-fluer lukker.Derefter bedøves og indsamles mindst 10 jomfruelige kvindelige afkom fra både G nul mandlige og kvindelige kryds. Sørg for, at hver F1-flue er mærket med detaljerne om dens afstamning og gemt separat. For at screene fluer for PCR skal du designe primere med en smeltetemperatur på omkring 55 grader Celsius, der omfatter målgenets redigeringssted.Forbered lysisbuffer for hver flueprøve, og dispenser 10 mikroliter i hver brønd i en 96 brønd PCR-plade. Oprethold bufferen ved en kold temperatur under bendissektionsprocessen. Forbered derefter glaskapillarrør, fyld den ene ende med saccharoseagarmad.Placer disse rør i en 96 brønd dyb brøndplade, kaldet flyvehotellet. Til bendissektion skal du placere kuldioxidbedøvelsespuden under et stereomikroskop. Bedøv en kandidatflue, og skær et af dens midterben.Derefter nedsænkes benet i lysisbufferen. Hold fluevingen med en fin metaltang. Flyt fluen til fluehotellet, og forsegl røret med garn med det samme.Opbevar fluehotellet i en ventileret inkubator, der holdes ved 25 grader Celsius og 60% fugtighed. Nedsænk de afskårne ben i lysisbufferopløsningen i en termisk cyklist. Organiser PCR-reaktionen som instrueret af producenten ved hjælp af 1,5 mikroliter fluebenlysat som DNA-kilde.Udsæt PCR-produkterne for agarosegelelektroforese, og fortolk resultaterne baseret på båndstørrelse. Baseret på gelresultaterne skal du vælge de positive fluer fra fluehotellet og krydse dem individuelt med balancefluer for at producere F2-generationen. Brug homozygote lagre til Sanger-sekventering af redigeringsstedet for at sikre nøjagtighed.Back-cross validerede flueliner med vildtypefluer for at fjerne baggrundsmutationer. Skærm hver generation ved hjælp af PCR-protokollen med et enkelt ben. Konfokale mikroskopbilleder af voksne Drosophila-hjerner viste periodeprotein organiseret i diskrete nukleare foci i løbet af de sene aften- og tidlige morgentidspunkter.Samlet set er denne protokol robust, hvis dine genotype-PCR-primere er specifikke.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulering af flugt Opførsel i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bestemmelse af Spontan motorisk aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Ligetil Assay til kvantificering af Social undgåelse i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Forhold, der påvirker sociale rum i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Høj opløsning Kvantificering af Lugt-styrede adfærd i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Brug af<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

En Behavioral Assay for Mechanosensation af MARCM-baserede kloner i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Fouragering Sti-længde Protokol for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

Den kapillære Feeder-analysen Måler fødeindtagelse i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyse Synaptic Graduering af<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptorer efter Udsættelse for Langvarig Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...