Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

We danken George Watase en Josie Clowney voor de discussies tijdens de beginfase van de ontwikkeling van het protocol. Het werk werd ondersteund door fondsen van de NIH (subsidie nr. R35GM133737 aan S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (aan S.Y.) en McKnight Scholar Award (aan S.Y.).

1. Ontwerp en constructie van reagentia voor het bewerken van genen
OPMERKING: Om endogene tagging uit te voeren, is het essentieel om de verschillende isovormen van het gewenste gen te identificeren. Afhankelijk van de specifieke doelen van het experiment kan een fluorescerende tag worden inwendig of aan de N- of C-termini van de geselecteerde eiwitisovorm(en) worden ingebouwd. Voor een optimale CRISPR-gemedieerde bewerking is het van cruciaal belang om de twee sgRNA's voldoende dicht bij de be...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

De resultaten demonstreren een gestroomlijnde, eenvoudige CRISPR-gebaseerde strategie in één stap voor het taggen van endogene genen in Drosophila. In het protocol gebruiken we twee gRNA's om DNA-dubbelstrengsbreuk en homologe recombinatie efficiënter te induceren. De gRNA's en het donorplasmide worden geïnjecteerd in fruitvliegembryo's, die het Cas9-enzym tot expressie brengen in hun kiembaan. Deze embryo's worden vervolgens onder standaardomstandigheden gekweekt tot ze volwassen zijn, waarna ze worden gekr...

Fluorescerende eiwitten zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen voor het visualiseren van eiwitlokalisatie, dynamiek en eiwit-eiwitinteracties in cellen in levende organismen 1,2. Het taggen van endogene genen met fluorescerende eiwitten maakt langdurige live beeldvorming van cellulaire processen met subcellulaire resolutie mogelijk. Bovendien hebben deze endogene gen-labelingtechnieken verschillende voordelen ten opzichte van overexpressie- en immunokleuringsbenaderingen. Overexpressie van eiwitten kan bijvoorbeeld leiden tot verkeerde eiwitvouwing, niet-specifieke eiwit-eiwitinteracties en verkeerde lokalisatie3. Tot op heden zijn onderzoekers in staat geweest om enorme bibliotheken van endogene genen te creëren die zijn gefuseerd met fluorescerende eiwitten voor een paar modelorganismen, zoals ontluikende gist, die efficiënte homologe recombinatie kunnen ondergaan4. In het geval van Drosophila melanogaster zijn verschillende hulpmiddelen zoals MiMIC's5, op transposon gebaseerde enhancervallen6 en fosmiden7 bedacht om genen fluorescerend te labelen.
De ontwikkeling van op CRISPR-Cas9 gebaseerde tools heeft het mogelijk gemaakt om genoombewerking, inclusief het taggen van endogene eiwitten, efficiënt uit te voeren in een breed scala aan modelorganismen 8,9. Cas9 is een RNA-geleid enzym dat dubbelstrengs DNA op een zeer efficiënte en specifieke manier splitst8, dat vervolgens kan worden gerepareerd door een niet-homologe eindverbinding (NHEJ) -route die leidt tot puntmutaties of -deleties. Als alternatief maakt de homologie-directed repair (HDR)-route de integratie van heteroloog DNA in het chromosoom mogelijk.
Eerdere methoden voor op CRISPR gebaseerde gentagging in het modelorganisme, Drosophila melanogaster, waren gebaseerd op een tweestapsproces 10,11,12. Dit omvat het gebruik van een waarneembare oogkleurmarkering, Dsred, om succesvolle HDR-gebeurtenissen te detecteren. Daarna zou de Dsred-marker worden weggesneden met behulp van het Cre/loxP-recombinatiesysteem. Om dit proces te stroomlijnen en te versnellen, presenteren we hier een eenvoudigere en efficiëntere methode. Deze aanpak omzeilt de noodzaak van dodelijke genotypering en maakt de directe screening van individuele vliegen mogelijk. In het bijzonder gebruiken we een op PCR gebaseerde benadering om DNA te extraheren uit een klein segment van de middelste poot van de vlieg, waardoor we individuele vliegen kunnen genotyperen. Deze procedure brengt met name de vitaliteit, beweging of voortplantingsmogelijkheden van de bemonsterde vlieg niet in gevaar. Alleen de geschikte individuen, die via deze methode worden geïdentificeerd, worden verder ontwikkeld tot stabiele bestanden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van fluorescerende eiwitgelabelde vliegen waarin endogene genen worden gelabeld met fluorescerende reporters. Deze techniek maakt gebruik van CRISPR-Cas9-genoombewerking om elke gewenste fluorofoortag te fuseren met de N- of C-terminal van een endogeen gen. Hieronder beschrijven we het ontwerp en de constructie van gRNA-plasmiden en een donorplasmide, een eenstapsscreeningsstrategie om CRISPR-positieve vliegen te selecteren en stappen om stabiele lijnen vast te stellen. In het bijzonder beschrijven we strategieën om een endogene kernklok Drosophila-gen, punt uit, te labelen met een fluorofoor aan de C-terminal. We beschrijven ook kort de controle-experimenten die moeten worden uitgevoerd om te bevestigen dat het gelabelde eiwit functioneel is en live-imaging-technieken om het periode-eiwit te visualiseren in levende klokneuronen in intacte Drosophila-hersenen 13. Het hier beschreven protocol is ook breed toepasbaar om kandidaten te screenen op deleties en inserties van specifieke stukjes DNA door CRISPR-Cas9 genoombewerking.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

De studie van subcellulaire lokalisatie, dynamiek en regulatie van eiwitten in levende cellen is ingrijpend getransformeerd door de komst van technieken die het mogelijk maken om endogene genen te labelen om fluorescerende fusie-eiwitten te produceren. Deze methoden stellen onderzoekers in staat om eiwitgedrag in realtime te visualiseren, wat waardevolle inzichten oplevert in hun functies en interacties binnen de cellulaire omgeving. Veel huidige onderzoeken naar het taggen van genen maken gebruik van een proces in twee stappen waarbij zichtbare markers, zoals veranderingen in de oogkleur, worden gebruikt om genetisch gemodificeerde organismen in de eerste stap te identificeren en de zichtbare marker in de tweede stap wordt weggesneden. Hier presenteren we een eenstapsprotocol om nauwkeurige en snelle endogene gentagging uit te voeren in Drosophila melanogaster, waardoor screening op gemanipuleerde lijnen mogelijk is zonder de zichtbare oogmarker, wat een aanzienlijk voordeel biedt ten opzichte van eerdere methoden. Om te screenen op succesvolle gen-tagging-gebeurtenissen, gebruiken we een op PCR gebaseerde techniek om individuele vliegen te genotyperen door een klein segment van hun middenpoot te analyseren. Vliegen die aan de screeningscriteria voldoen, worden vervolgens gebruikt om stabiele bestanden te produceren. Hier beschrijven we het ontwerp en de constructie van CRISPR-bewerkingsplasmiden en methoden voor het screenen en bevestigen van gemanipuleerde lijnen. Samen verbetert dit protocol de efficiëntie van endogene gentagging in Drosophila aanzienlijk en maakt het studies van cellulaire processen in vivo mogelijk.

In onze experimenten vonden we doorgaans een slagingspercentage van ~20%-30% bij het screenen op verschillende endogene gelabelde genen op alle chromosomen (X, II, III). De efficiëntie van dit proces kan variëren op basis van verschillende factoren, zoals gRNA-selectie, de aard van het gen en de injectiekwaliteit. Hier illustreren we de resultaten van onze strategie om het endogene periode-gen te labelen met de mNeonGreen fluorofoor13. Het menstruati...

Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Hier presenteren we een vereenvoudigd endogene gentagging-protocol voor Drosophila, dat gebruik maakt van een op PCR gebaseerde techniek voor markervrije identificatie van succesvolle genetische modificaties, waardoor de ontwikkeling van stabiele knock-in-lijnen wordt vergemakkelijkt.

Op CRISPR gebaseerde strategie in één stap voor endogene gentagging in Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Het doel van dit protocol is om een endogene bewerkte vlieglijn te genereren. We laten een fluorescerende eiwit-knock-in zien als voorbeeld, maar het kan ook worden toegepast op andere knock-in, knock-out en mutatiegeneratie. Ons protocol is een op CRISPR gebaseerde methode op basis van homologe recombinatie, dus er is bijna geen beperking op mutatieplaatsen.Bovendien heeft ons protocol de tijd en moeite die gemoeid zijn met genotyperingsstappen aanzienlijk verminderd. Open om te beginnen de CRISPR-website om sgRNA's voor Drosophila te ontwerpen en voer ongeveer 100 basenpaarsequenties in rond de gewenste knock-in-locatie. Selecteer CRISPR-doelen met de vijf belangrijkste guanine-opties.Klik op de knop CRISPR-doelen zoeken om een lijst met mogelijke sgRNA-sequenties te genereren. Klik vervolgens op de knop evalueren voor elke sequentie en kies twee sgRNA's die nul off-targets hebben. Aangezien de natuurlijke eiwitexpressieniveaus doorgaans veel lager zijn, selecteert u fluorescerende tags die helder en fotostabiel zijn en passen bij de experimentele opstelling.Ontwerp vervolgens een linker om epitooptags te koppelen aan de fluorescerende marker voor biochemische analyse. Gebruik een linkerpeptide variërend van twee tot 20 aminozuren, bestaande uit aminozuren zoals glycine en serine. Om de donorvector voor Drosophila te ontwerpen, organiseert u de DNA-sequentie van het linkerpeptide en de fluorescerende tag en zorgt u voor homologe sequenties die beide uiteinden flankeren.Wijzig eventuele PAM-sequenties in het donorplasmide om de resulterende aminozuursequentie van eiwitten te behouden. Plaats vervolgens de start- en stopcodons, afhankelijk van de locatie van de tag. Zorg er voor interne tagging voor dat de fluorescerende tag in beeld is met de coderende sequentie van het doelgen.Voor N-terminus-tagging plaatst u de fluorescerende tag na het endogene startcodon. Voor C-terminus-tagging plaatst u de fluorescerende tag vóór het natuurlijke stopcodon. Zorg ervoor dat u slechts één startcodon behoudt om mogelijke vertaalproblemen te voorkomen.Gebruik de alternatieve, op restrictie-enzymen gebaseerde kloonbenadering om de sgRNA-sequentie in het plasmide U6 Bbs1-chiRNA-plasmide in te voegen. Na het maken van het sgRNA-plasmide, transformeert u het plasmide in DH5-Alpha Escherichia coli volgens de instructies van de fabrikant. Controleer de resulterende klonen door middel van Sanger-sequencing, met behulp van T3- of T7-standaardsequencingprimers.Om het donorplasmide te maken, gebruikt u dubbelstrengs DNA met de gewenste sequentie en integreert u het in de plasmide Bluesript 2SK-negatieve meervoudige kloonplaats. Sequentie van het donorplasmide om ervoor te zorgen dat sgRNA- of PAM-sequenties correct worden gewijzigd en dat er geen SNP's in het plasmide aanwezig zijn. Neem vervolgens Cas9-vliegen geïnjecteerd met het geconstrueerde gRNA en donorplasmiden.Verdoof de vliegen met kooldioxide en scheid mannelijke vliegen en maagdelijke vrouwtjes. Om vliegenkruisingen tot stand te brengen, koppelt u elk G zero-mannetje aan ten minste twee FM7L-maagdelijke vrouwtjes in individuele smalle CT-voedselflesjes. Plaats gekruiste injectieflacons in een geventileerde incubator die op 25 graden Celsius en 60% luchtvochtigheid wordt gehouden totdat de F1-vliegen sluiten.Verdoof en verzamel vervolgens ten minste 10 maagdelijke vrouwelijke nakomelingen van zowel mannelijke als vrouwelijke kruisingen van G zero. Zorg ervoor dat elke F1-vlieg is getagd met de details van zijn afkomst en apart wordt opgeslagen. Om vliegen op PCR te screenen, ontwerpt u primers met een smelttemperatuur van ongeveer 55 graden Celsius die de bewerkingsplaats van het doelgen omvatten.Bereid lysisbuffer voor elk vliegmonster en doseer 10 microliter in elk putje van een PCR-plaat met 96 putjes. Houd de buffer op een koude temperatuur tijdens het beendissectieproces. Bereid vervolgens glazen capillaire buizen voor en vul het ene uiteinde met sucrose-agarvoedsel.Plaats deze buizen in een plaat met 96 putjes en diepe putten, ook wel het vlieghotel genoemd. Voor beendissectie plaatst u het kooldioxide-verdovingskussen onder een stereomicroscoop. Verdoof een kandidaat-vlieg en snijd een van zijn middenpoten door.Dompel daarna het been onder in de lysisbuffer. Houd de vliegenvleugel vast met een fijne metalen pincet. Verplaats de vlieg naar het vliegenhotel en sluit de buis onmiddellijk af met garen.Huisvest het vliegenhotel in een geventileerde incubator die wordt gehandhaafd op 25 graden Celsius en een luchtvochtigheid van 60%. Dompel de afgehakte benen onder in de lysisbufferoplossing in een thermische cycler. Organiseer de PCR-reactie volgens de instructies van de fabrikant, met 1,5 microliter van het vliegpootlysaat als DNA-bron.Onderwerp de PCR-producten aan agarosegelelektroforese en interpreteer de resultaten op basis van de bandgrootte. Selecteer op basis van de gelresultaten de positieve vliegen uit het vlieghotel en kruis ze individueel met balancervliegen om de F2-generatie te produceren. Gebruik homozygote aandelen voor Sanger-sequencing van de bewerkingssite om nauwkeurigheid te garanderen.Back-cross gevalideerde vlieglijnen met wildtype vliegen om achtergrondmutaties te verwijderen. Screen elke generatie met behulp van het PCR-protocol met één been. Confocale microscoopbeelden van volwassen Drosophila-hersenen toonden periode-eiwit georganiseerd in discrete nucleaire brandpunten gedurende de late nacht en vroege ochtend.Over het algemeen is dit protocol robuust als uw genotypering PCR-primers specifiek zijn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulatie van Escape Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Aandoeningen van de sociale ruimte in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Hoge-resolutie Kwantificering van Geur-begeleide Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Met behulp van de<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Een Behavioral Assay voor Mechanosensation van MARCM-gebaseerde klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foerageren Path-length Protocol<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larven

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

De capillaire Feeder test meet voedselinname bij<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...