Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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Nous remercions George Watase et Josie Clowney pour les discussions qui ont eu lieu au cours des premières étapes de l’élaboration du protocole. Le travail a été soutenu par des fonds du NIH (subvention n° R35GM133737 à S.Y.), de la bourse Alfred P. Sloan (à S. Y.) et du McKnight Scholar Award (à S. Y.).

1. Conception et construction de réactifs d’édition de gènes
NOTE : Pour effectuer un marquage endogène, il est essentiel d’identifier les différentes isoformes du gène souhaité. Selon les objectifs spécifiques de l’expérience, une étiquette fluorescente peut être incorporée soit en interne, soit aux extrémités N ou C de la ou des isoformes de protéines sélectionnées. Pour une édition optimale médiée par CRISPR, il est crucial de positionner les deux ARNsg à proximité...

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	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

Les résultats démontrent une stratégie simplifiée et simple basée sur CRISPR en une étape pour marquer les gènes endogènes chez la drosophile. Dans le protocole, nous utilisons deux ARNg pour induire plus efficacement la cassure double brin de l’ADN et la recombinaison homologue. Les ARNg et le plasmide donneur sont injectés dans des embryons de mouches des fruits, qui expriment l’enzyme Cas9 dans leur lignée germinale. Ces embryons sont ensuite cultivés dans des conditions standard jusqu’à l?...

Les protéines fluorescentes sont devenues des outils puissants pour visualiser la localisation des protéines, la dynamique et les interactions protéine-protéine dans les cellules des organismes vivants 1,2. Le marquage des gènes endogènes avec des protéines fluorescentes permet d’imager en direct à long terme les processus cellulaires avec une résolution subcellulaire. De plus, ces techniques de marquage de gènes endogènes présentent plusieurs avantages par rapport aux approches de surexpression et d’immunomarquage. Par exemple, la surexpression des protéines peut entraîner un mauvais repliement des protéines, des interactions protéine-protéine non spécifiques et une mauvaise localisation3. À ce jour, les chercheurs ont pu créer de vastes bibliothèques de gènes endogènes fusionnés à des protéines fluorescentes pour quelques organismes modèles, tels que la levure bourgeonnante, qui peuvent subir une recombinaison homologue efficace4. Dans le cas de Drosophila melanogaster, divers outils tels que MiMICs5, les pièges amplificateurs à base de transposons6 et les fosmids7 ont été conçus pour marquer les gènes par fluorescence.
Le développement d’outils basés sur CRISPR-Cas9 a permis d’effectuer efficacement l’édition du génome, y compris le marquage des protéines endogènes, dans un large éventail d’organismes modèles 8,9. Cas9 est une enzyme guidée par l’ARN qui clive l’ADN double brin d’une manière très efficace et spécifique8, qui peut ensuite être réparée par une voie de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) conduisant à des mutations ponctuelles ou à des délétions ponctuelles. Alternativement, la voie de réparation dirigée par homologie (HDR) permet l’intégration de l’ADN hétérologue dans le chromosome.
Les méthodes antérieures de marquage génique basé sur CRISPR dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster, reposaient sur un processus en deux étapes 10,11,12. Cela implique l’utilisation d’un marqueur de couleur des yeux discernable, Dsred, pour détecter les événements HDR réussis. Ensuite, le marqueur Dsred serait excisé à l’aide du système de recombinaison Cre/loxP. Pour rationaliser et accélérer ce processus, nous vous présentons ici une méthode plus simple et plus efficace. Cette approche contourne le besoin de génotypage létal et permet le dépistage direct des mouches individuelles. Plus précisément, nous utilisons une approche basée sur la PCR pour extraire l’ADN d’un petit segment de la patte médiane de la mouche, ce qui nous permet de génotyper des mouches individuelles. Notamment, cette procédure ne compromet pas la vitalité, le mouvement ou les capacités de reproduction de la mouche échantillonnée. Seuls les individus appropriés, identifiés par cette méthode, sont développés en stocks stables.
Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer des mouches marquées par des protéines fluorescentes dans lesquelles les gènes endogènes sont marqués avec des rapporteurs fluorescents. Cette technique utilise l’édition du génome CRISPR-Cas9 pour fusionner n’importe quelle étiquette fluorophore souhaitée à la terminaison N ou C d’un gène endogène. Ci-dessous, nous décrivons la conception et la construction de plasmides d’ARNg et d’un plasmide donneur, la stratégie de criblage en une étape pour sélectionner les mouches positives à CRISPR et les étapes pour établir des lignées stables. Plus précisément, nous décrivons des stratégies pour marquer un gène endogène de la drosophile, point final, avec un fluorophore à l’extrémité C-terminale. Nous décrivons également brièvement les expériences de contrôle qui doivent être effectuées pour confirmer que la protéine marquée est fonctionnelle et les techniques d’imagerie en direct pour visualiser la protéine Period dans les neurones de l’horloge vivante dans les cerveaux intacts de la drosophile 13. Le protocole décrit ici est également largement applicable au criblage des candidats pour les délétions et les insertions de morceaux d’ADN spécifiques par édition du génome CRISPR-Cas9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

L’étude de la localisation, de la dynamique et de la régulation subcellulaires des protéines dans les cellules vivantes a été profondément transformée par l’avènement de techniques permettant le marquage de gènes endogènes pour produire des protéines de fusion fluorescentes. Ces méthodes permettent aux chercheurs de visualiser le comportement des protéines en temps réel, fournissant des informations précieuses sur leurs fonctions et leurs interactions dans l’environnement cellulaire. De nombreuses études actuelles sur le marquage génétique utilisent un processus en deux étapes où les marqueurs visibles, tels que les changements de couleur des yeux, sont utilisés pour identifier les organismes génétiquement modifiés dans la première étape, et le marqueur visible est excisé dans la deuxième étape. Ici, nous présentons un protocole en une étape pour effectuer un marquage génétique endogène précis et rapide chez Drosophila melanogaster, qui permet de dépister des lignées modifiées sans marqueur oculaire visible, offrant un avantage significatif par rapport aux méthodes précédentes. Pour dépister les événements de marquage génétique réussis, nous utilisons une technique basée sur la PCR pour génotyper des mouches individuelles en analysant un petit segment de leur patte médiane. Les mouches qui répondent aux critères de sélection sont ensuite utilisées pour produire des stocks stables. Ici, nous détaillons la conception et la construction des plasmides d’édition CRISPR et les méthodes de criblage et de confirmation des lignées modifiées. Ensemble, ce protocole améliore considérablement l’efficacité du marquage génétique endogène chez la drosophile et permet d’étudier les processus cellulaires in vivo.

Dans nos expériences, nous avons généralement trouvé un taux de réussite de ~20 % à 30 % dans le dépistage de divers gènes endogènes marqués sur tous les chromosomes (X, II, III). L’efficacité de ce processus peut varier en fonction de plusieurs facteurs, tels que la sélection de l’ARNg, la nature du gène et la qualité de l’injection. Nous illustrons ici les résultats de notre stratégie de marquage du gène de la période endogène avec le fluorophore mNeonG...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Ici, nous présentons un protocole simplifié de marquage génétique endogène pour la drosophile, qui utilise une technique basée sur la PCR pour l’identification sans marqueur des modifications génétiques réussies, facilitant le développement de lignées d’inclusion stables.

Stratégie basée sur CRISPR en une étape pour le marquage des gènes endogènes chez Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Le but de ce protocole est de générer une ligne de mouche éditée endogène. Nous montrons un knock-in de protéine fluorescente à titre d’exemple, mais il pourrait également être appliqué à d’autres knock-in, knock-out, ainsi qu’à la génération de mutations. Notre protocole est une méthode basée sur la recombinaison homologue CRISPR, il n’y a donc presque aucune restriction sur les sites de mutation.De plus, notre protocole a considérablement réduit le temps et les efforts nécessaires aux étapes de génotypage. Pour commencer, ouvrez le site Web CRISPR pour concevoir des ARNsg pour la drosophile et entrez environ 100 séquences de paires de bases autour de l’emplacement d’insertion souhaité. Sélectionnez les cibles CRISPR avec l’option de guanine à cinq primes.Cliquez sur le bouton Trouver des cibles CRISPR pour générer une liste de séquences d’ARNsg possibles. Cliquez ensuite sur le bouton d’évaluation pour chaque séquence et choisissez deux ARNsg qui n’ont aucune cible hors cible. Étant donné que les niveaux d’expression des protéines naturelles sont généralement beaucoup plus faibles, sélectionnez des marqueurs fluorescents qui sont brillants et photostables, et qui correspondent à la configuration expérimentale.Ensuite, concevez un agent de liaison pour relier les étiquettes d’épitopes au marqueur fluorescent pour l’analyse biochimique. Utilisez un peptide de liaison allant de deux à 20 acides aminés, comprenant des acides aminés comme la glycine et la sérine. Pour concevoir le vecteur donneur de la drosophile, organiser la séquence d’ADN du peptide de liaison et de l’étiquette fluorescente, et s’assurer que les séquences homologues flanquent les deux extrémités.Modifiez toutes les séquences PAM dans le plasmide donneur pour maintenir la séquence d’acides aminés des protéines résultante. Ensuite, positionnez les codons de début et d’arrêt en fonction de l’emplacement de la balise. Pour le marquage interne, assurez-vous que l’étiquette fluorescente est dans le cadre de la séquence codante du gène cible.Pour le marquage N-terminal, positionnez l’étiquette fluorescente après le codon de départ endogène. Pour le marquage C-terminal, placez l’étiquette fluorescente avant le codon stop naturel. Assurez-vous de ne conserver qu’un seul codon de départ pour éviter les problèmes de traduction potentiels.Utilisez l’approche alternative de clonage basée sur les enzymes de restriction pour insérer la séquence d’ARNsg dans le plasmide plasmide U6 Bbs1-chiRNA. Après avoir créé le plasmide d’ARNsg, transformez-le en DH5-Alpha Escherichia coli selon les instructions du fabricant. Vérifiez les clones résultants par séquençage de Sanger, en utilisant des amorces de séquençage standard T3 ou T7.Pour créer le plasmide donneur, utilisez de l’ADN double brin avec la séquence souhaitée et intégrez-le dans le site de clonage multiple négatif du plasmide Bluesript 2SK. Séquencez le plasmide du donneur pour vous assurer que les séquences d’ARNsg ou de PAM sont correctement modifiées et qu’il n’y a pas de SNP présents dans le plasmide. Ensuite, prenez des mouches Cas9 injectées avec l’ARNg construit et les plasmides donneurs.Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone et séparer les mouches mâles et les femelles vierges. Pour établir des croisements de mouches, appariez chaque mâle G zéro avec au moins deux femelles vierges FM7L dans des flacons alimentaires CT étroits individuels. Placez les flacons croisés dans un incubateur ventilé maintenu à 25 degrés Celsius et 60 % d’humidité jusqu’à ce que les mouches F1 se ferment.Ensuite, anesthésier et recueillir au moins 10 descendants femelles vierges issus de croisements mâles et femelles G zéro. Assurez-vous que chaque mouche F1 est étiquetée avec les détails de sa filiation et stockée séparément. Pour dépister les mouches pour la PCR, concevez des amorces avec une température de fusion d’environ 55 degrés Celsius qui englobent le site d’édition du gène cible.Préparez un tampon de lyse pour chaque échantillon de mouche et distribuez 10 microlitres dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits. Maintenez le tampon à une température froide pendant le processus de dissection de la jambe. Ensuite, préparez des tubes capillaires en verre, en remplissant une extrémité de nourriture à base de gélose saccharose.Placez ces tubes dans une plaque de puits de 96 puits de profondeur, appelée l’hôtel à mouches. Pour le curage des jambes, placez le tampon d’anesthésie au dioxyde de carbone sous un stéréomicroscope. Anesthésie une mouche candidate et sectionne l’une de ses pattes centrales.Après cela, plongez la jambe dans le tampon de lyse. Tenez l’aile de la mouche avec une paire de pinces métalliques fines. Déplacez la mouche vers l’hôtel à mouches et scellez immédiatement le tube avec du fil.Hébergez l’hôtel dans un incubateur ventilé maintenu à 25 degrés Celsius et 60% d’humidité. Immerger les jambes coupées dans la solution tampon de lyse dans un thermocycleur. Organisez la réaction PCR selon les instructions du fabricant, en utilisant 1,5 microlitre de lysat de patte de mouche comme source d’ADN.Soumettre les produits de PCR à l’électrophorèse sur gel d’agarose et interpréter les résultats en fonction de la taille de la bande. Sur la base des résultats du gel, sélectionnez les mouches positives de l’hôtel de mouches et croisez-les individuellement avec des mouches d’équilibrage pour produire la génération F2. Utilisez des stocks homozygotes pour le séquençage Sanger du site d’édition afin d’assurer la précision.Rétrocroisez des lignes de mouche validées avec des mouches de type sauvage pour éliminer les mutations de fond. Criblez chaque génération à l’aide du protocole PCR à jambe unique. Des images au microscope confocal de cerveaux de drosophiles adultes ont montré des protéines menstruelles organisées en foyers nucléaires discrets tout au long de la nuit et tôt le matin.Dans l’ensemble, ce protocole est robuste si vos amorces de génotypage PCR sont spécifiques.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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