Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

אנו מודים לג'ורג' ווטאס וג'וזי קלוני על הדיונים בשלבים הראשונים של פיתוח הפרוטוקול. העבודה נתמכה על ידי קרנות מה-NIH (מענק מס' R35GM133737 ל-S.Y.), מלגת אלפרד פ. סלואן (ל-S. Y.) ו-McKnight Scholar Award (ל-S. Y).

1. תכנון ובנייה של ריאגנטים לעריכת גנים
הערה: כדי לבצע תיוג אנדוגני, חיוני לזהות את האיזופורמים השונים של הגן הרצוי. בהתאם למטרות הספציפיות של הניסוי, ניתן לשלב תג פלואורסצנטי באופן פנימי או במסוף N או C של איזופורמ(י) החלבון שנבחר. לעריכה אופטימלית בתיווך CRISPR, חיוני למקם את שני ...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

התוצאות מדגימות אסטרטגיה יעילה ופשוטה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה. בפרוטוקול, אנו משתמשים בשני gRNA כדי לגרום לשבירת DNA דו-גדילי ורקומבינציה הומולוגית בצורה יעילה יותר. ה-gRNA והפלסמיד התורם מוזרקים לעוברים של זבובי פירות, המבטאים את האנזים Cas9 בקו הנבט שלהם. עוברי...

חלבונים פלואורסצנטיים התגלו ככלים רבי עוצמה להדמיית לוקליזציה של חלבונים, דינמיקה ואינטראקציות חלבון-חלבון בתאים בתוך אורגניזמים חיים 1,2. תיוג גנים אנדוגניים בחלבונים פלואורסצנטיים מאפשר הדמיה חיה ארוכת טווח של תהליכים תאיים ברזולוציה תת-תאית. יתר על כן, לטכניקות תיוג גנים אנדוגניות אלה יש מספר יתרונות בהשוואה לגישות ביטוי יתר וצביעת חיסון. לדוגמה, ביטוי יתר של חלבונים עלול להוביל לקיפול שגוי של חלבונים, אינטראקציות חלבון-חלבון לא ספציפיות וחוסר לוקליזציה3. עד כה, חוקרים הצליחו ליצור ספריות עצומות של גנים אנדוגניים המאוחים לחלבונים פלואורסצנטיים עבור כמה אורגניזמים לדוגמה, כגון שמרים ניצנים, אשר יכולים לעבור רקומבינציה הומולוגית יעילה4. במקרה של Drosophila melanogaster, כלים שונים כגון MiMICs5, מלכודות משפר מבוסס טרנספוזון6, ו fosmids7 פותחו כדי לתייג גנים פלואורסצנטית.
פיתוח כלים מבוססי CRISPR-Cas9 איפשר לבצע ביעילות עריכת גנום, כולל תיוג חלבונים אנדוגניים, במגוון רחב של אורגניזם מודל 8,9. Cas9 הוא אנזים מונחה רנ"א אשר חותך דנ"א דו-גדילי באופן יעיל וספציפיביותר 8, אשר לאחר מכן ניתן לתקן על ידי מסלול הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ) המוביל למוטציות נקודתיות או מחיקות. לחלופין, מסלול תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מאפשר שילוב של DNA הטרולוגי לתוך הכרומוזום.
שיטות קודמות לתיוג גנים מבוססי קריספר באורגניזם המודל, Drosophila melanogaster, הסתמכו על תהליך דו-שלבי 10,11,12. זה כרוך בשימוש בסמן צבע עיניים מובחן, Dsred, כדי לזהות אירועי HDR מוצלחים. לאחר מכן, סמן Dsred יוסר באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre/loxP. כדי לייעל ולזרז את התהליך, אנו מציגים כאן שיטה פשוטה ויעילה יותר. גישה זו עוקפת את הצורך בגנוטיפ קטלני ומאפשרת סריקה ישירה של זבובים בודדים. באופן ספציפי, אנו משתמשים בגישה מבוססת PCR כדי לחלץ דנ"א מקטע קטן של הרגל האמצעית של הזבוב, מה שמאפשר לנו לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים. יש לציין כי הליך זה אינו פוגע בחיוניות, בתנועה או ביכולות הרבייה של הזבוב שנדגם. רק האנשים המתאימים, המזוהים בשיטה זו, מתפתחים עוד יותר למניות יציבות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת חלבון פלואורסצנטי מתויג זבובים שבו גנים אנדוגניים מסומנים עם כתבים פלואורסצנטיים. טכניקה זו משתמשת בעריכת גנום CRISPR-Cas9 כדי להתיך כל תג פלואורופור רצוי למסוף N או C של גן אנדוגני. להלן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של פלסמידים gRNA ופלסמיד תורם, אסטרטגיית סינון בצעד אחד לבחירת זבובים חיוביים לקריספר, וצעדים ליצירת קווים יציבים. באופן ספציפי, אנו מתארים אסטרטגיות לתיוג שעון ליבה אנדוגני גן דרוזופילה , נקודה, עם פלואורופור במסוף C. אנו גם מתארים בקצרה את ניסויי הבקרה שיש לבצע כדי לאשר שהחלבון המתויג הוא פונקציונלי וטכניקות הדמיה חיה כדי לדמיין את חלבון המחזור בנוירונים של שעון חי בתוך מוחות דרוזופילה שלמים13. הפרוטוקול המתואר כאן חל באופן נרחב גם על מועמדים לסינון מחיקות והחדרות של פיסות DNA ספציפיות על ידי עריכת גנום CRISPR-Cas9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

המחקר של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים, דינמיקה וויסות בתאים חיים השתנה באופן עמוק עם הופעתן של טכניקות המאפשרות תיוג של גנים אנדוגניים לייצר חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. שיטות אלה מאפשרות לחוקרים לדמיין את התנהגות החלבונים בזמן אמת, ומספקות תובנות חשובות לגבי תפקודיהם ואינטראקציות שלהם בסביבה התאית. מחקרים רבים כיום על תיוג גנים משתמשים בתהליך דו-שלבי שבו סמנים נראים לעין, כגון שינויים בצבע העיניים, משמשים לזיהוי אורגניזמים מהונדסים גנטית בשלב הראשון, והסמן הנראה נכרת בשלב השני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול חד שלבי לביצוע תיוג גנים אנדוגני מדויק ומהיר ב - Drosophila melanogaster, המאפשר סריקה לקווים מהונדסים ללא סמן העין הנראה, ומציע יתרון משמעותי על פני שיטות קודמות. כדי לסנן אירועי תיוג גנים מוצלחים, אנו משתמשים בטכניקה מבוססת PCR כדי לבצע גנוטיפ של זבובים בודדים על ידי ניתוח מקטע קטן מהרגל האמצעית שלהם. זבובים שעוברים את קריטריוני הסינון משמשים לאחר מכן לייצור מלאי יציב. כאן, אנו מפרטים את התכנון והבנייה של פלסמידים לעריכת CRISPR ושיטות לסינון ואישור של קווים מהונדסים. יחד, פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי את יעילות תיוג הגנים האנדוגניים בדרוזופילה ומאפשר מחקרים של תהליכים תאיים in vivo.

בניסויים שלנו, מצאנו בדרך כלל שיעור הצלחה של ~20%-30% בבדיקות סקר לגנים מתויגים אנדוגניים שונים על כל הכרומוזומים (X, II, III). יעילותו של תהליך זה יכולה להשתנות בהתאם למספר גורמים, כגון בחירת gRNA, אופי הגן ואיכות ההזרקה. כאן, אנו ממחישים את התוצאות מהאסטרטגיה שלנו לתייג את גן התק...

Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.

אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

מטרת פרוטוקול זה היא ליצור קו זבוב ערוך אנדוגני. אנו מראים חלבון פלואורסצנטי כדוגמה, אבל זה יכול להיות מיושם גם על נוק-אין אחרים, נוקאאוט, כמו גם יצירת מוטציות. הפרוטוקול שלנו הוא שיטה מבוססת רקומבינציה הומולוגית CRISPR, כך שאין כמעט הגבלה על אתרי מוטציות.יתר על כן, הפרוטוקול שלנו צמצם מאוד את הזמן והמאמץ הכרוכים בשלבי גנוטיפ. כדי להתחיל, פתחו את אתר Fly CRISPR כדי לעצב sgRNA עבור דרוזופילה, והזינו כ-100 רצפי זוגות בסיסים סביב מיקום הדפיקה הרצוי. בחרו יעדי CRISPR עם האפשרות 'חמש גואנין מובחרות'.לחץ על הלחצן Find CRISPR targets כדי ליצור רשימה של רצפי sgRNA אפשריים. לאחר מכן לחץ על לחצן ההערכה עבור כל רצף, ובחר שני sgRNA שיש להם אפס מטרות מחוץ ליעד. מכיוון שרמות ביטוי החלבון הטבעיות הן בדרך כלל נמוכות בהרבה, בחרו תגים פלואורסצנטיים בהירים וניתנים לצילום, והתאימו למערך הניסוי.לאחר מכן, עצבו מקשר כדי לקשר תגי אפיטופ לסמן הפלואורסצנטי לצורך ניתוח ביוכימי. השתמשו בפפטיד מקשר המכיל בין שתיים ל-20 חומצות אמינו, המכילות חומצות אמינו כמו גליצין וסרין. כדי לתכנן את וקטור התורם לדרוזופילה, ארגנו את רצף הדנ"א של הפפטיד המקשר ואת התג הפלואורסצנטי, וודאו רצפים הומולוגיים משני הקצוות.שנה את כל רצפי PAM בתוך פלסמיד התורם כדי לשמור על רצף חומצות האמינו של החלבונים המתקבלים. לאחר מכן, מקם את קודוני ההתחלה והעצירה בהתאם למיקום התג. לתיוג פנימי, ודא שהתג הפלואורסצנטי נמצא במסגרת עם רצף הקידוד של גן היעד.לתיוג N-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי אחרי קודון ההתחלה האנדוגני. לתיוג C-terminus, מקם את התג הפלואורסצנטי לפני קודון העצירה הטבעי. הקפד לשמור רק קודון התחלה אחד כדי למנוע בעיות תרגום פוטנציאליות.השתמש בגישת השיבוט החלופית המבוססת על אנזים הגבלה כדי להכניס את רצף sgRNA לפלסמיד פלסמיד U6 Bbs1-chiRNA. לאחר יצירת פלסמיד sgRNA, הפוך את הפלסמיד ב- DH5-Alpha Escherichia coli בהתאם להוראות היצרן. אמת את השיבוטים המתקבלים באמצעות ריצוף Sanger, באמצעות פריימרים לריצוף סטנדרטי T3 או T7.כדי ליצור את פלסמיד התורם, השתמש בדנ"א דו-גדילי עם הרצף הרצוי, ושלב אותו באתר השיבוט המרובים השלילי של פלסמיד Bluesript 2SK. רצף את פלסמיד התורם כדי להבטיח שרצפי sgRNA או PAM משתנים כראוי ואין SNPs נוכחים בפלסמיד. לאחר מכן, קח זבובי Cas9 המוזרקים עם gRNA בנוי פלסמידים תורם.מרדימים את הזבובים בפחמן דו חמצני, ומפרידים בין זבובים זכרים לנקבות בתולות. כדי לבסס צלבי זבובים, זיווג כל זכר G zero עם לפחות שתי נקבות בתולות FM7L בבקבוקוני מזון CT צרים בודדים. הניחו בקבוקונים מוצלבים באינקובטור מאוורר הנשמר בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות של 60% עד שטיסות F1 נסגרות.לאחר מכן הרדימו ואספו לפחות 10 צאצאים נקבות בתולות משני הצלבים הזכריים והנקביים של G zero. ודא שכל זבוב F1 מתויג עם פרטי ההורות שלו ומאוחסן בנפרד. כדי לסנן זבובים עבור PCR, תכננו פריימרים עם טמפרטורת התכה של כ-55 מעלות צלזיוס המקיפים את אתר העריכה של גן המטרה.הכינו חיץ ליזיס לכל דגימת זבוב, ושחררו 10 מיקרוליטר לכל באר של צלחת PCR 96 באר. שמור על החיץ בטמפרטורה קרה במהלך תהליך דיסקציה של הרגל. לאחר מכן, להכין צינורות נימי זכוכית, מילוי קצה אחד עם מזון אגר סוכרוז.מניחים צינורות אלה בצלחת באר עמוקה 96, המכונה מלון הזבוב. לדיסקציה של הרגליים, מקמו את משטח ההרדמה של פחמן דו חמצני מתחת למיקרוסקופ סטריאו. מרדימים זבוב מועמד, וכורתים את אחת מרגליו האמצעיות.לאחר מכן, לטבול את הרגל לתוך חיץ ליזיס. החזיקו את כנף הזבוב בעזרת זוג מלקחיים עדינים ממתכת. העבירו את הזבוב למלון הזבובים, ואטמו מיד את הצינור בחוט.אכלסו את מלון הזבובים באינקובטור מאוורר המתוחזק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-60% לחות. השקיעו את הרגליים הכרותות בתמיסת חיץ הליזיס במחזור תרמי. ארגן את תגובת ה- PCR לפי הוראות היצרן, באמצעות 1.5 מיקרוליטר של רגל הזבוב ליזט כמקור ה- DNA.יש להעביר את מוצרי ה-PCR לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז, ולפרש את התוצאות על סמך גודל הרצועה. בהתבסס על תוצאות הג'ל, בחרו את הזבובים החיוביים ממלון הזבובים והצליבו אותם בנפרד עם זבובי איזון כדי לייצר את דור ה-F2. השתמש במניות הומוזיגוטיות לריצוף Sanger של אתר העריכה כדי להבטיח דיוק.הצלבה אחורית של קווי זבובים מאומתים עם זבובים מסוג בר כדי להסיר מוטציות רקע. מסך כל דור באמצעות פרוטוקול PCR על רגל אחת. תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של מוחות דרוזופילה בוגרים הראו חלבון תקופתי מאורגן במוקדים גרעיניים דיסקרטיים לאורך שעות הלילה המאוחרות ושעות הבוקר המוקדמות.בסך הכל, פרוטוקול זה חזק אם פריימרים PCR גנוטיפ שלך הם ספציפיים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

קביעת הפעילות של תנועה הספונטנית ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Assay הפשוט לכימות חברתיות הימנעות ב<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

תנאים המשפיעים על המרחב חברתי ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; שימוש ב<em&gt; Flywalk</em&gt; פרדיגמה

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

התנהגות Assay עבור Mechanosensation של MARCM מבוסס משובט ב<em&gt; תסיסנית melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...