Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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हम प्रोटोकॉल विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान चर्चा के लिए जॉर्ज वातासे और जोसी क्लॉनी को धन्यवाद देते हैं। काम को एनआईएच (अनुदान संख्या R35GM133737 से एसवाई), अल्फ्रेड पी. स्लोन फैलोशिप (एसवाई को) और मैकनाइट स्कॉलर अवार्ड (एसवाई को) से धन द्वारा समर्थित किया गया था।

1. जीन संपादन अभिकर्मकों का डिजाइन और निर्माण
नोट: अंतर्जात टैगिंग करने के लिए, वांछित जीन के विभिन्न आइसोफॉर्म की पहचान करना आवश्यक है। प्रयोग के विशिष्ट लक्ष्यों के आधार पर, एक फ्लोरोसेंट टै...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

परिणाम ड्रोसोफिला में अंतर्जात जीन को टैग करने के लिए एक सुव्यवस्थित, सरल एक-चरण सीआरआईएसपीआर-आधारित रणनीति प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल में, हम डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक और होमोलॉगस पुनर्संयोज?...

फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवित जीवों 1,2 के भीतर कोशिकाओं में प्रोटीन स्थानीयकरण, गतिशीलता, और प्रोटीन प्रोटीन बातचीत visualizing के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ अंतर्जात जीन टैगिंग उपकोशिकीय संकल्प के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं की दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इन अंतर्जात जीन-लेबलिंग तकनीकों में अतिअभिव्यक्ति और इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण की तुलना में कई फायदे हैं। उदाहरण के लिए, प्रोटीन की overexpression प्रोटीन misfolding, निरर्थक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत, और mislocalization3 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. तिथि करने के लिए, शोधकर्ताओं इस तरह के नवोदित खमीर, जो कुशल homologous पुनर्संयोजन4 से गुजरना कर सकते हैं के रूप में कुछ मॉडल जीवों, के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन से जुड़े अंतर्जात जीन के विशाल पुस्तकालयों का निर्माण करने में सक्षम किया गया है. ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के मामले में, एमआईएमआईसी5, ट्रांसपोसॉन-आधारित एन्हांसर ट्रैप6, और फॉस्मिड्स7 जैसे विभिन्न उपकरण जीन को फ्लोरोसेंटली टैग करने के लिए तैयार किए गए हैं।
सीआरआईएसपीआर-कैस 9-आधारित उपकरणों के विकास ने मॉडल जीव 8,9 की एक विस्तृत श्रृंखला में अंतर्जात प्रोटीन को टैग करने सहित जीनोम संपादन को कुशलतापूर्वक करना संभव बना दिया है। Cas9 एक आरएनए-निर्देशित एंजाइम है जो अत्यधिक कुशल और विशिष्ट तरीके से डबल-फंसे डीएनए को क्लीवेज करता है8, जिसे तब एक गैर-समरूप अंत-जुड़ने (NHEJ) मार्ग द्वारा मरम्मत की जा सकती है जिससे बिंदु उत्परिवर्तन या विलोपन होता है। वैकल्पिक रूप से, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) मार्ग गुणसूत्र में विषम डीएनए के एकीकरण की अनुमति देता है।
मॉडल जीव में सीआरआईएसपीआर आधारित जीन टैगिंग के लिए पिछले विधियों, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, एक दो कदम प्रक्रिया10,11,12पर भरोसा किया है. इसमें सफल एचडीआर घटनाओं का पता लगाने के लिए एक स्पष्ट आंखों के रंग मार्कर, डीएसरेड का उपयोग करना शामिल है। बाद में, Dsred मार्कर को Cre/loxP पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके निकाला जाएगा। इस प्रक्रिया को सुव्यवस्थित और तेज करने के लिए, यहां, हम एक सरल और अधिक कुशल तरीका प्रस्तुत करते हैं। यह दृष्टिकोण घातक जीनोटाइपिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है और व्यक्तिगत मक्खियों की प्रत्यक्ष जांच की अनुमति देता है। विशेष रूप से, हम मक्खी के मध्य पैर के एक छोटे से खंड से डीएनए निकालने के लिए एक पीसीआर आधारित दृष्टिकोण को रोजगार, हमें व्यक्तिगत मक्खियों जीनोटाइप करने के लिए अनुमति देता है. विशेष रूप से, यह प्रक्रिया नमूना मक्खी की जीवन शक्ति, आंदोलन या प्रजनन क्षमताओं से समझौता नहीं करती है। इस पद्धति के माध्यम से पहचाने जाने वाले केवल उपयुक्त व्यक्तियों को ही स्थिर स्टॉक में विकसित किया जाता है।
यहां, हम फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसमें अंतर्जात जीन फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ लेबल किए जाते हैं। यह तकनीक किसी भी वांछित फ्लोरोफोर टैग को एक अंतर्जात जीन के एन- या सी-टर्मिनल में फ्यूज करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन का उपयोग करती है। नीचे, हम जीआरएनए प्लास्मिड और एक दाता प्लास्मिड के डिजाइन और निर्माण का वर्णन करते हैं, सीआरआईएसपीआर-पॉजिटिव मक्खियों का चयन करने के लिए एक-चरण स्क्रीनिंग रणनीति, और स्थिर लाइनों को स्थापित करने के लिए कदम। विशेष रूप से, हम सी-टर्मिनल पर फ्लोरोफोर के साथ एक अंतर्जात कोर घड़ी ड्रोसोफिला जीन, अवधि को टैग करने के लिए रणनीतियों का वर्णन करते हैं। हम भी संक्षेप में नियंत्रण प्रयोगों है कि टैग प्रोटीन कार्यात्मक और जिंदा इमेजिंग तकनीक बरकरार ड्रोसोफिला दिमाग13 के भीतर रहते घड़ी न्यूरॉन्स में अवधि प्रोटीन कल्पना करने के लिए पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया जा करने की आवश्यकता का वर्णन. यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर-कैस 9 जीनोम संपादन द्वारा डीएनए के विशिष्ट बिट्स के विलोपन और सम्मिलन के लिए स्क्रीन उम्मीदवारों पर भी व्यापक रूप से लागू होता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण, गतिशीलता, और जीवित कोशिकाओं में विनियमन का अध्ययन गहराई से तकनीक है कि अंतर्जात जीन के टैगिंग फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए अनुमति के आगमन से बदल दिया गया है. ये विधियां शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में प्रोटीन व्यवहार की कल्पना करने में सक्षम बनाती हैं, जिससे सेलुलर वातावरण के भीतर उनके कार्यों और इंटरैक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि मिलती है। कई वर्तमान जीन टैगिंग अध्ययन दो-चरणीय प्रक्रिया को नियोजित करते हैं जहां दृश्यमान मार्कर, जैसे कि आंखों के रंग में परिवर्तन, का उपयोग पहले चरण में आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों की पहचान करने के लिए किया जाता है, और दृश्यमान मार्कर को दूसरे चरण में निकाला जाता है। यहां, हम ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में सटीक और तेजी से अंतर्जात जीन टैगिंग करने के लिए एक-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो पिछले तरीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हुए, दृश्यमान आंख मार्कर के बिना इंजीनियर लाइनों के लिए स्क्रीनिंग को सक्षम बनाता है। सफल जीन-टैगिंग घटनाओं के लिए स्क्रीन करने के लिए, हम अपने मध्य पैर से एक छोटे से खंड का विश्लेषण करके व्यक्तिगत मक्खियों को जीनोटाइप करने के लिए एक पीसीआर-आधारित तकनीक का उपयोग करते हैं। स्क्रीनिंग मानदंडों को पार करने वाली मक्खियों का उपयोग स्थिर स्टॉक का उत्पादन करने के लिए किया जाता है। यहां, हम सीआरआईएसपीआर संपादन प्लास्मिड के डिजाइन और निर्माण और इंजीनियर लाइनों की स्क्रीनिंग और पुष्टि के तरीकों का विस्तार करते हैं। साथ में, यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में अंतर्जात जीन टैगिंग की दक्षता में काफी सुधार करता है और विवो में सेलुलर प्रक्रियाओं के अध्ययन को सक्षम बनाता है।

हमारे प्रयोगों में, हम आम तौर पर सभी गुणसूत्रों (एक्स, द्वितीय, तृतीय) पर विभिन्न अंतर्जात टैग जीन के लिए स्क्रीनिंग में ~ 20% -30% की सफलता दर पाया. इस प्रक्रिया की दक्षता कई कारकों के आधार पर भिन्?...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

यहां, हम ड्रोसोफिला के लिए एक सरलीकृत अंतर्जात जीन टैगिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो सफल आनुवंशिक संशोधनों की मार्कर-मुक्त पहचान के लिए पीसीआर-आधारित तकनीक का उपयोग करता है, जिससे स्थिर नॉक-इन लाइनों के विकास की सुविधा मिलती है।

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में अंतर्जात जीन टैगिंग के लिए एक-चरण सीआरआईएसपीआर-आधारित रणनीति

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक अंतर्जात संपादित मक्खी लाइन उत्पन्न करने के लिए है. हम एक उदाहरण के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन नॉक-इन दिखाते हैं, लेकिन इसे अन्य नॉक-इन, नॉकआउट, साथ ही उत्परिवर्तन पीढ़ी पर भी लागू किया जा सकता है। हमारा प्रोटोकॉल एक सीआरआईएसपीआर समरूप पुनर्संयोजन आधारित विधि है, इसलिए उत्परिवर्तन साइटों पर लगभग कोई प्रतिबंध नहीं है।इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल बहुत समय और जीनोटाइपिंग कदम में शामिल प्रयास कम कर दिया. शुरू करने के लिए, ड्रोसोफिला के लिए एसजीआरएनए डिजाइन करने के लिए फ्लाई सीआरआईएसपीआर वेबसाइट खोलें, और वांछित नॉक-इन स्थान के आसपास लगभग 100 बेस जोड़ी अनुक्रम दर्ज करें। पांच प्रमुख गुआनिन विकल्प के साथ सीआरआईएसपीआर लक्ष्यों का चयन करें।संभावित एसजीआरएनए अनुक्रमों की सूची उत्पन्न करने के लिए सीआरआईएसपीआर लक्ष्य खोजें बटन पर क्लिक करें। फिर प्रत्येक अनुक्रम के लिए मूल्यांकन बटन पर क्लिक करें, और शून्य बंद लक्ष्य है कि दो sgRNAs चुनें. चूंकि प्राकृतिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर आम तौर पर बहुत कम होता है, इसलिए फ्लोरोसेंट टैग का चयन करें जो उज्ज्वल और फोटोटेबल हैं, और प्रयोगात्मक सेटअप फिट होते हैं।इसके बाद, जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर को एपिटोप टैग से जोड़ने के लिए एक लिंकर डिज़ाइन करें। दो से 20 अमीनो एसिड तक के लिंकर पेप्टाइड का उपयोग करें, जिसमें ग्लाइसिन और सेरीन जैसे अमीनो एसिड शामिल हैं। ड्रोसोफिला के लिए दाता वेक्टर को डिजाइन करने के लिए, लिंकर पेप्टाइड और फ्लोरोसेंट टैग के डीएनए अनुक्रम को व्यवस्थित करें, और दोनों सिरों को फ़्लैंक करने वाले समरूप अनुक्रम सुनिश्चित करें।परिणामी प्रोटीन एमिनो एसिड अनुक्रम को बनाए रखने के लिए दाता प्लाज्मिड के भीतर किसी भी पीएएम दृश्यों को संशोधित करें। अगला, टैग स्थान के आधार पर कोडन को प्रारंभ और बंद करें। आंतरिक टैगिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट टैग लक्ष्य जीन के कोडिंग अनुक्रम के साथ फ्रेम में है।एन-टर्मिनस टैगिंग के लिए, अंतर्जात प्रारंभ कोडन के बाद फ्लोरोसेंट टैग की स्थिति बनाएं। सी-टर्मिनस टैगिंग के लिए, फ्लोरोसेंट टैग को प्राकृतिक स्टॉप कोडन से पहले रखें। संभावित अनुवाद मुद्दों से बचने के लिए केवल एक ही प्रारंभ कोडन बनाए रखना सुनिश्चित करें।प्लाज्मिड U6 Bbs1-chiRNA प्लास्मिड में एसजीआरएनए अनुक्रम डालने के लिए वैकल्पिक प्रतिबंध एंजाइम आधारित क्लोनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करें। एसजीआरएनए प्लास्मिड बनाने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लास्मिड को डीएच 5-अल्फा एस्चेरिचिया कोलाई में बदल दें। सेंगर अनुक्रमण के माध्यम से परिणामी क्लोन सत्यापित करें, या तो टी 3 या टी 7 मानक अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग कर.दाता प्लास्मिड बनाने के लिए, वांछित अनुक्रम के साथ डबल-फंसे डीएनए का उपयोग करें, और इसे प्लास्मिड ब्लूस्रिप्ट 2SK नकारात्मक एकाधिक क्लोनिंग साइट में एकीकृत करें। दाता प्लास्मिड अनुक्रम सुनिश्चित करने के लिए एसजीआरएनए या पीएएम अनुक्रमों को सही ढंग से संशोधित किया गया है और प्लास्मिड में मौजूद कोई एसएनपी नहीं हैं। अगला, निर्मित जीआरएनए और दाता प्लास्मिड के साथ इंजेक्शन Cas9 मक्खियों ले लो.कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें, और नर मक्खियों और कुंवारी मादाओं को अलग करें। फ्लाई क्रॉस स्थापित करने के लिए, प्रत्येक जी शून्य पुरुष को व्यक्तिगत संकीर्ण सीटी खाद्य शीशियों में कम से कम दो एफएम 7 एल कुंवारी महिलाओं के साथ जोड़ दें। 25 डिग्री सेल्सियस और 60% आर्द्रता पर बनाए रखा एक हवादार इनक्यूबेटर में पार शीशियों प्लेस जब तक F1 मक्खियों नज़दीक.फिर जी शून्य पुरुष और महिला क्रॉस दोनों से कम से कम 10 कुंवारी महिला संतानों को संवेदनाहारी और इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक F1 फ्लाई को उसके माता-पिता के विवरण के साथ टैग किया गया है और अलग से संग्रहीत किया गया है। पीसीआर के लिए मक्खियों को स्क्रीन करने के लिए, लगभग 55 डिग्री सेल्सियस के पिघलने वाले तापमान के साथ प्राइमरों को डिजाइन करें जो लक्ष्य जीन के संपादन स्थल को शामिल करते हैं।प्रत्येक मक्खी नमूना के लिए lysis बफर तैयार करें, और एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक कुएं में 10 माइक्रोलीटर बांटना. पैर विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान एक ठंडे तापमान पर बफर बनाए रखें. अगला, ग्लास केशिका ट्यूब तैयार करें, सुक्रोज अगर भोजन के साथ एक छोर भरना।इन ट्यूबों को 96 अच्छी तरह से गहरी अच्छी तरह से प्लेट में रखें, जिसे फ्लाई होटल कहा जाता है। पैर विच्छेदन के लिए, एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत कार्बन डाइऑक्साइड anesthetization पैड स्थिति. एक उम्मीदवार मक्खी को एनेस्थेटाइज करें, और उसके मध्य पैरों में से एक को अलग करें।उसके बाद, पैर को लाइसिस बफर में डुबो दें। ठीक धातु संदंश की एक जोड़ी के साथ मक्खी पंख पकड़ो. मक्खी होटल के लिए मक्खी ले जाएँ, और तुरंत यार्न के साथ ट्यूब सील.फ्लाई होटल को 25 डिग्री सेल्सियस और 60% आर्द्रता पर बनाए गए एक वेंटेड इनक्यूबेटर में रखें। एक थर्मल साइक्लर में lysis बफर समाधान में कटे हुए पैरों को डुबोएं। निर्माता द्वारा निर्देश के अनुसार पीसीआर प्रतिक्रिया को व्यवस्थित करें, डीएनए स्रोत के रूप में फ्लाई लेग लाइसेट के 1.5 माइक्रोलीटर का उपयोग करें।पीसीआर उत्पादों को अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन के अधीन करें, और बैंड आकार के आधार पर परिणामों की व्याख्या करें। जेल परिणामों के आधार पर, फ्लाई होटल से सकारात्मक मक्खियों का चयन करें और व्यक्तिगत रूप से उन्हें F2 पीढ़ी का उत्पादन करने के लिए बैलेंसर मक्खियों के साथ पार करें। सटीकता सुनिश्चित करने के लिए संपादन साइट के सेंगर अनुक्रमण के लिए समयुग्मजी स्टॉक का उपयोग करें।पृष्ठभूमि उत्परिवर्तन को हटाने के लिए जंगली प्रकार मक्खियों के साथ बैक-क्रॉस मान्य फ्लाई लाइनें। सिंगल लेग पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रत्येक पीढ़ी को स्क्रीन करें। वयस्क ड्रोसोफिला दिमाग की कन्फोकल माइक्रोस्कोप छवियों ने देर रात और सुबह के समय बिंदुओं में विचारशील परमाणु foci में आयोजित अवधि प्रोटीन दिखाया।कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल मजबूत है यदि आपके जीनोटाइपिंग पीसीआर प्राइमर विशिष्ट हैं।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic भागने व्यवहार की उत्तेजना<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

में सहज हरकत गतिविधि का निर्धारण<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

सामाजिक परिहार की मात्रा में लिए सीधा परख<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

में सामाजिक अंतरिक्ष प्रभावित करने की स्थिति<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

गंध निर्देशित व्यवहार के उच्च संकल्प मात्रा<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; का प्रयोग<em&gt; Flywalk</em&gt; प्रतिमान

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

के Mechanosensation के लिए एक व्यवहार परख क्लोन में MARCM आधारित<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

चारा के लिए पथ-लंबाई प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; लार्वा

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

केशिका फीडर परख में खाद्य सेवन के उपाय<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

एक साधारण एक कदम प्रौढ़ की साबुत माउंट तैयारी के लिए विच्छेदन प्रोटोकॉल<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; दिमाग

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

के Synaptic मॉड्यूलेशन का विश्लेषण<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क के बाद फोटोरिसेप्टर

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...