Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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Ringraziamo George Watase e Josie Clowney per le discussioni durante le fasi iniziali dello sviluppo del protocollo. Il lavoro è stato sostenuto da fondi del NIH (sovvenzione n. R35GM133737 a S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (a S. Y.) e McKnight Scholar Award (a S. Y.).

1. Progettazione e costruzione di reagenti per l'editing genetico
NOTA: Per effettuare la marcatura endogena è fondamentale identificare le varie isoforme del gene desiderato. A seconda degli obiettivi specifici dell'esperimento, un tag fluorescente può essere incorporato internamente o ai termini N o C dell'isoforma proteica selezionata. Per un editing ottimale mediato da CRISPR, è fondamentale posizionare i due sgRNA adeguatamente vicini al sito knock-in previsto. Successivamente, per conse...

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	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

I risultati dimostrano una strategia semplificata e semplice basata su CRISPR in un solo passaggio per l'etichettatura dei geni endogeni in Drosophila. Nel protocollo, utilizziamo due gRNA per indurre la rottura del doppio filamento del DNA e la ricombinazione omologa in modo più efficiente. I gRNA e il plasmide donatore vengono iniettati in embrioni di moscerino della frutta, che esprimono l'enzima Cas9 nella loro linea germinale. Questi embrioni vengono successivamente coltivati in condizioni standard fino al...

Le proteine fluorescenti sono emerse come potenti strumenti per visualizzare la localizzazione, la dinamica e le interazioni proteina-proteina nelle cellule all'interno degli organismi viventi 1,2. L'etichettatura di geni endogeni con proteine fluorescenti consente l'imaging dal vivo a lungo termine dei processi cellulari con risoluzione subcellulare. Inoltre, queste tecniche di marcatura genica endogena presentano diversi vantaggi rispetto agli approcci di sovraespressione e immunocolorazione. Ad esempio, la sovraespressione delle proteine potrebbe portare a un misfolding proteico, a interazioni proteina-proteina non specifiche e a un'errata localizzazione3. Ad oggi, i ricercatori sono stati in grado di creare vaste librerie di geni endogeni fusi a proteine fluorescenti per alcuni organismi modello, come il lievito in gemmazione, che possono subire un'efficiente ricombinazione omologa4. Nel caso di Drosophila melanogaster, sono stati messi a punto vari strumenti come le MiMICs5, le trappole enhancer6 basate su trasposoni e i fosmidi7 per marcare i geni in modo fluorescente.
Lo sviluppo di strumenti basati su CRISPR-Cas9 ha reso possibile eseguire in modo efficiente l'editing del genoma, compresa la marcatura di proteine endogene, in un'ampia gamma di organismi modello 8,9. Cas9 è un enzima guidato dall'RNA che scinde il DNA a doppio filamento in modo altamente efficiente e specifico8, che può quindi essere riparato da una via di giunzione non omologa (NHEJ) che porta a mutazioni puntiformi o delezioni. In alternativa, la via di riparazione diretta dall'omologia (HDR) consente l'integrazione del DNA eterologo nel cromosoma.
I metodi precedenti per la marcatura genica basata su CRISPR nell'organismo modello, Drosophila melanogaster, si sono basati su un processo in due fasi 10,11,12. Ciò comporta l'utilizzo di un marcatore del colore degli occhi distinguibile, Dsred, per rilevare eventi HDR di successo. Successivamente, il marcatore Dsred verrebbe asportato utilizzando il sistema di ricombinazione Cre/loxP. Per semplificare e accelerare questo processo, qui presentiamo un metodo più semplice ed efficiente. Questo approccio aggira la necessità di genotipizzazione letale e consente lo screening diretto dei singoli moscerini. In particolare, impieghiamo un approccio basato sulla PCR per estrarre il DNA da un piccolo segmento della zampa centrale della mosca, consentendoci di genotipizzare i singoli moscerini. In particolare, questa procedura non compromette la vitalità, il movimento o le capacità riproduttive della mosca campionata. Solo gli individui appropriati, identificati attraverso questo metodo, vengono ulteriormente sviluppati in stock stabili.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di mosche marcate con proteine fluorescenti in cui i geni endogeni sono marcati con reporter fluorescenti. Questa tecnica utilizza l'editing del genoma CRISPR-Cas9 per fondere qualsiasi tag fluoroforo desiderato al terminale N o C di un gene endogeno. Di seguito, descriviamo la progettazione e la costruzione di plasmidi gRNA e di un plasmide donatore, la strategia di screening in un'unica fase per selezionare i moscerini positivi a CRISPR e i passaggi per stabilire linee stabili. In particolare, descriviamo strategie per marcare un gene endogeno dell'orologio centrale della Drosophila, punto, con un fluoroforo al C-terminale. Descriviamo anche brevemente gli esperimenti di controllo che devono essere eseguiti per confermare che la proteina marcata è funzionale e tecniche di imaging dal vivo per visualizzare la proteina del periodo nei neuroni dell'orologio vivo all'interno di cervelli intatti di Drosophila 13. Il protocollo qui descritto è anche ampiamente applicabile ai candidati allo screening per le delezioni e gli inserimenti di specifici frammenti di DNA mediante l'editing del genoma CRISPR-Cas9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

Lo studio della localizzazione, della dinamica e della regolazione subcellulare delle proteine nelle cellule vive è stato profondamente trasformato dall'avvento di tecniche che consentono il tagging di geni endogeni per produrre proteine di fusione fluorescenti. Questi metodi consentono ai ricercatori di visualizzare il comportamento delle proteine in tempo reale, fornendo preziose informazioni sulle loro funzioni e interazioni all'interno dell'ambiente cellulare. Molti studi attuali di marcatura genica impiegano un processo in due fasi in cui i marcatori visibili, come i cambiamenti del colore degli occhi, vengono utilizzati per identificare gli organismi geneticamente modificati nella prima fase e il marcatore visibile viene asportato nella seconda fase. Qui, presentiamo un protocollo in un'unica fase per eseguire un marcatura genica endogena precisa e rapida in Drosophila melanogaster, che consente lo screening di linee ingegnerizzate senza il marcatore oculare visibile, offrendo un vantaggio significativo rispetto ai metodi passati. Per lo screening di eventi di marcatura genica di successo, impieghiamo una tecnica basata sulla PCR per genotipizzare i singoli moscerini analizzando un piccolo segmento della loro zampa centrale. Le mosche che superano i criteri di screening vengono quindi utilizzate per produrre stock stabili. Qui, descriviamo in dettaglio la progettazione e la costruzione di plasmidi di editing CRISPR e metodi per lo screening e la conferma di linee ingegnerizzate. Insieme, questo protocollo migliora significativamente l'efficienza del tagging genico endogeno in Drosophila e consente studi sui processi cellulari in vivo.

Nei nostri esperimenti, abbiamo in genere riscontrato un tasso di successo di ~20%-30% nello screening per vari geni marcati endogeni su tutti i cromosomi (X, II, III). L'efficienza di questo processo può variare in base a diversi fattori, come la selezione del gRNA, la natura del gene e la qualità dell'iniezione. Qui, illustriamo i risultati della nostra strategia per marcare il gene del periodo endogeno con il fluoroforo mNeonGreen13. Il gene mestr...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Qui, presentiamo un protocollo di marcatura genica endogena semplificato per Drosophila, che utilizza una tecnica basata sulla PCR per l'identificazione senza marcatori di modificazioni genetiche di successo, facilitando lo sviluppo di linee knock-in stabili.

Strategia basata su CRISPR in un'unica fase per il tagging genico endogeno in Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Lo scopo di questo protocollo è quello di generare una linea di mosca modificata endogena. Mostriamo come esempio un knock-in di una proteina fluorescente, ma potrebbe anche essere applicato ad altri knock-in, knockout e generazione di mutazioni. Il nostro protocollo è un metodo basato sulla ricombinazione omologa CRISPR, quindi non c'è quasi nessuna restrizione sui siti di mutazione.Inoltre, il nostro protocollo ha ridotto notevolmente il tempo e l'impegno necessari per le fasi di genotipizzazione. Per iniziare, apri il sito web di CRISPR per progettare sgRNA per Drosophila e inserisci circa 100 sequenze di coppie di basi che circondano la posizione di knock-in desiderata. Seleziona i bersagli CRISPR con l'opzione cinque prime guanina.Fare clic sul pulsante Trova target CRISPR per generare un elenco di possibili sequenze di sgRNA. Quindi fare clic sul pulsante Valuta per ogni sequenza e scegliere due sgRNA che non hanno bersagli esterni. Poiché i livelli naturali di espressione proteica sono in genere molto più bassi, selezionare tag fluorescenti che siano luminosi e fotostabili e che si adattino alla configurazione sperimentale.Successivamente, progettare un linker per collegare i tag dell'epitopo al marcatore fluorescente per l'analisi biochimica. Utilizzare un peptide linker che va da due a 20 aminoacidi, comprendente aminoacidi come glicina e serina. Per progettare il vettore donatore per Drosophila, organizzare la sequenza di DNA del peptide linker e del tag fluorescente e garantire sequenze omologhe che fiancheggiano entrambe le estremità.Modificare qualsiasi sequenza PAM all'interno del plasmide donatore per mantenere la sequenza aminoacidica delle proteine risultante. Quindi, posiziona i codoni di inizio e fine in base alla posizione del tag. Per l'etichettatura interna, assicurarsi che l'etichetta fluorescente sia inquadrata con la sequenza codificante del gene bersaglio.Per l'etichettatura N-terminale, posizionare il tag fluorescente dopo il codone di inizio endogeno. Per l'etichettatura C-terminale, posizionare l'etichetta fluorescente prima del codone di stop naturale. Assicurarsi di mantenere un solo codone iniziale per evitare potenziali problemi di traduzione.Utilizzare l'approccio di clonaggio alternativo basato sull'enzima di restrizione per inserire la sequenza di sgRNA nel plasmide U6 Bbs1-chiRNA plasmide. Dopo aver creato il plasmide sgRNA, trasformare il plasmide in DH5-Alpha Escherichia coli secondo le istruzioni del produttore. Verificare i cloni risultanti attraverso il sequenziamento Sanger, utilizzando primer di sequenziamento standard T3 o T7.Per creare il plasmide donatore, utilizzare il DNA a doppio filamento con la sequenza desiderata e integrarlo nel sito di clonazione multipla negativo del plasmide Bluesript 2SK. Sequenziare il plasmide del donatore per garantire che le sequenze di sgRNA o PAM siano modificate correttamente e che non siano presenti SNP nel plasmide. Successivamente, prendi le mosche Cas9 iniettate con il gRNA costruito e i plasmidi del donatore.Anestetizzare le mosche con anidride carbonica e separare le mosche maschi dalle femmine vergini. Per stabilire gli incroci di mosca, accoppiare ogni maschio G zero con almeno due femmine vergini FM7L in singole fiale di cibo CT strette. Mettere le fiale incrociate in un'incubatrice ventilata mantenuta a 25 gradi Celsius e al 60% di umidità fino a quando le mosche F1 non si avvicinano.Quindi anestetizzare e raccogliere almeno 10 figli femminili vergini da incroci maschili e femminili G zero. Assicurati che ogni mosca F1 sia etichettata con i dettagli della sua parentela e conservata separatamente. Per lo screening dei moscerini per la PCR, progettare primer con una temperatura di fusione di circa 55 gradi Celsius che comprendano il sito di editing del gene bersaglio.Preparare il tampone di lisi per ogni campione di mosca ed erogare 10 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Mantenere il tampone a una temperatura fredda durante il processo di dissezione delle gambe. Quindi, prepara i tubi capillari di vetro, riempiendo un'estremità con cibo agar saccarosio.Posiziona questi tubi in una piastra profonda 96 pozzetti, denominata hotel volante. Per la dissezione delle gambe, posizionare il tampone per anestesia con anidride carbonica sotto uno stereomicroscopio. Anestetizzare una mosca candidata e recidere una delle sue zampe centrali.Dopodiché, immergi la gamba nel tampone di lisi. Tieni l'ala della mosca con un paio di pinze di metallo fine. Sposta la mosca nell'hotel della mosca e sigilla immediatamente il tubo con il filo.Ospita l'hotel delle mosche in un'incubatrice ventilata mantenuta a 25 gradi Celsius e al 60% di umidità. Immergere le gambe recise nella soluzione tampone di lisi in un termociclatore. Organizzare la reazione PCR come indicato dal produttore, utilizzando 1,5 microlitri di lisato di zampe di mosca come fonte di DNA.Sottoporre i prodotti PCR all'elettroforesi su gel di agarosio e interpretare i risultati in base alla dimensione della banda. Sulla base dei risultati del gel, selezionare le mosche positive dall'hotel della mosca e incrociarle singolarmente con le mosche bilanciatrici per produrre la generazione F2. Utilizzare supporti omozigoti per il sequenziamento Sanger del sito di editing per garantire l'accuratezza.Linee di mosca convalidate all'incrocio con mosche wild type per rimuovere le mutazioni di fondo. Eseguire lo screening di ogni generazione utilizzando il protocollo PCR a gamba singola. Le immagini al microscopio confocale di cervelli adulti di Drosophila hanno mostrato proteine mestruali organizzate in discreti focolai nucleari durante la tarda notte e la mattina presto.Nel complesso, questo protocollo è robusto se i primer PCR di genotipizzazione sono specifici.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

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