Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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プロトコル開発の初期段階で議論してくれたGeorge Watase氏とJosie Clowney氏に感謝します。この研究は、NIH(助成金番号R35GM133737、Alfred P. Sloan Fellowship(S.Y.)、McKnight Scholar Award(S.Y.)からの資金によって支援されました。

1. 遺伝子編集試薬の設計・構築
注:内在性タグ付けを行うには、目的の遺伝子のさまざまなアイソフォームを同定することが不可欠です。実験の特定の目的に応じて、蛍光タグを内部に、または選択したタンパク質アイソフォームのN末端またはC末端に組み込むことができます。CRISPRを介した編集を最適に行うには、2つのsgRNAを目的のノックイン部位に適切に配置すること?...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

この結果は、 ショウジョウバエの内在性遺伝子にタグを付けるための、合理化されたシンプルなワンステップCRISPRベースの戦略を示しています。プロトコルでは、2つのgRNAを使用して、DNA二本鎖切断と相同組換えをより効率的に誘導します。gRNAとドナープラスミドをショウジョウバエの胚に注入し、ショウジョウバエの胚は生殖細胞系でCas9酵素を発現します。これらの胚は、その後?...

蛍光タンパク質は、生体内の細胞におけるタンパク質の局在、動態、およびタンパク質間相互作用を可視化するための強力なツールとして登場しました1,2。内在性遺伝子に蛍光タンパク質をタグ付けすることで、細胞内分解能で細胞プロセスの長期ライブイメージングが可能になります。さらに、これらの内在性遺伝子標識技術には、過剰発現および免疫染色アプローチと比較していくつかの利点があります。例えば、タンパク質の過剰発現は、タンパク質のミスフォールディング、非特異的なタンパク質間相互作用、および局在の誤りにつながる可能性があります3。現在までに、研究者は、効率的な相同組換えを受けることができる出芽酵母などのいくつかのモデル生物について、蛍光タンパク質に融合した内因性遺伝子の膨大なライブラリを作成することができました4。ショウジョウバエの場合、MiMICs5、トランスポゾンベースのエンハンサートラップ6、フォスミド7など、遺伝子を蛍光標識するために様々なツールが考案されている。
CRISPR-Cas9ベースのツールの開発により、幅広いモデル生物において、内在性タンパク質のタグ付けを含むゲノム編集を効率的に行うことが可能になりました8,9。Cas9は、二本鎖DNAを高効率かつ特異的に切断するRNA誘導酵素であり8、その後、点変異または欠失につながる非相同末端結合(NHEJ)経路によって修復することができます。あるいは、相同性指向性修復(HDR)経路により、異種DNAの染色体への組み込みが可能になります。
モデル生物であるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)におけるCRISPRベースの遺伝子タグ付けの過去の方法は、2段階のプロセスに依存していた10,11,12。これには、識別可能な目の色のマーカーである Dsred を使用して、成功した HDR イベントを検出することが含まれます。その後、Cre/loxP組換えシステムを用いてDsredマーカーを切除します。このプロセスを合理化および迅速化するために、ここでは、よりシンプルで効率的な方法を紹介します。このアプローチにより、致死的なジェノタイピングの必要性が回避され、個々のハエの直接スクリーニングが可能になります。具体的には、PCRベースのアプローチを採用して、ハエの中脚の小さなセグメントからDNAを抽出し、個々のハエの遺伝子型を決定できるようにします。特に、この手順は、サンプリングされたハエの活力、運動、または繁殖能力を損なうことはありません。この方法で特定された適切な個人のみが、安定した株式にさらに開発されます。
ここでは、内因性遺伝子が蛍光レポーターで標識された蛍光タンパク質タグ付きハエを生成するための詳細なプロトコルを紹介します。この技術では、CRISPR-Cas9ゲノム編集を使用して、任意の蛍光色素タグを内因性遺伝子のN末端またはC末端に融合させます。以下では、gRNAプラスミドとドナープラスミドの設計と構築、CRISPR陽性ハエを選択するためのワンステップスクリーニング戦略、および安定した系統を確立するためのステップについて説明します。具体的には、内在性コアクロックのショウジョウバエ遺伝子periodをC末端の蛍光色素でタグ付けする戦略について述べる。また、タグ付けされたタンパク質が機能的であることを確認するために実施する必要がある対照実験と、無傷のショウジョウバエ脳内のライブクロックニューロンの周期タンパク質を視覚化するためのライブイメージング技術についても簡単に説明します13。ここで説明するプロトコルは、CRISPR-Cas9ゲノム編集によるDNAの特定のビットの欠失および挿入の候補をスクリーニングするためにも広く適用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

生細胞におけるタンパク質の細胞内局在、動態、および調節の研究は、内因性遺伝子のタグ付けを可能にして蛍光融合タンパク質を産生する技術の出現によって大きく変化しました。これらの方法により、研究者はタンパク質の挙動をリアルタイムで視覚化し、細胞環境内でのタンパク質の機能と相互作用に関する貴重な洞察を得ることができます。現在の多くの遺伝子タグ付け研究では、最初のステップで目の色の変化などの目に見えるマーカーを使用して遺伝子組み換え生物を同定し、2番目のステップで目に見えるマーカーを切除する2段階のプロセスを採用しています。ここでは、ショウ ジョウバエの内因性遺伝子タグを正確かつ迅速に行うためのワンステッププロトコルを提示し、目に見えるアイマーカーなしで操作された系統のスクリーニングを可能にし、従来の方法に比べて大きな利点を提供します。成功した遺伝子タグ付けイベントをスクリーニングするために、PCRベースの技術を採用して、中脚からの小さなセグメントを分析することにより、個々のハエの遺伝子型を決定します。そして、審査基準をクリアしたハエは、安定した資源を生産するために利用されます。ここでは、CRISPR編集プラスミドの設計と構築、および操作されたラインのスクリーニングと確認の方法について詳しく説明します。一緒に、このプロトコルはショウ ジョウバエ の内生遺伝子の分類の効率をかなり改善し、生体内の細胞プロセスの調査を可能にする。

私たちの実験では、すべての染色体(X、II、III)上のさまざまな内因性タグ付き遺伝子のスクリーニングにおいて、通常、20%~30%の成功率が見られました。このプロセスの効率は、gRNAの選択、遺伝子の性質、注入品質など、いくつかの要因によって異なります。ここでは、内因性周期遺伝子をmNeonGreen蛍光色素でタグ付けする戦略の結果を説明します13...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

ここでは、成功した遺伝子組み換えをマーカーフリーで識別するためにPCRベースの技術を利用し、安定したノックインラインの開発を促進するショウジョウバエの簡略化された内因性遺伝子タグ付けプロトコルを紹介します。

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

このプロトコルの目的は、内因性編集されたフライラインを生成することです。ここでは蛍光タンパク質のノックインを例に挙げていますが、他のノックイン、ノックアウト、突然変異の生成にも応用できます。私たちのプロトコルはCRISPR相同組換えベースの方法であるため、変異部位に制限はほとんどありません。さらに、当社のプロトコルは、ジェノタイピングステップにかかる時間と労力を大幅に削減しました。まず、ショウジョウバエのsgRNAをデザインするためのfly CRISPRのウェブサイトを開き、目的のノックイン位置を囲む約100塩基対の配列を入力します。5プライムグアニンオプションでCRISPRターゲットを選択します。[CRISPRターゲットの検索]ボタンをクリックして、可能なsgRNA配列のリストを生成します。次に、各配列の評価ボタンをクリックし、オフターゲットがゼロの 2 つの sgRNA を選択します。天然のタンパク質発現レベルは通常はるかに低いため、明るく光安定性があり、実験セットアップに適合する蛍光タグを選択してください。次に、生化学分析のためにエピトープタグを蛍光マーカーにリンクするリンカーを設計します。グリシンやセリンなどのアミノ酸を含む2〜20アミノ酸のリンカーペプチドを使用します。ショウジョウバエのドナーベクターを設計するには、リンカーペプチドと蛍光タグのDNA配列を整理し、両末端に隣接する相同配列を確保します。ドナープラスミド内のPAM配列を修飾して、得られたタンパク質のアミノ酸配列を維持します。次に、タグの位置に応じて開始コドンとストップコドンを配置します。内部タグ付けの場合は、蛍光タグが標的遺伝子のコード配列とフレーム内にあることを確認してください。N末端タグ付けでは、内因性開始コドンの後に蛍光タグを配置します。C末端タグ付けでは、蛍光タグを自然終止コドンの前に配置します。潜在的な翻訳の問題を回避するために、開始コドンを1つだけ保持するようにしてください。代替の制限酵素ベースのクローニングアプローチを使用して、sgRNA配列をプラスミドU6 Bbs1-chiRNAプラスミドに挿入します。sgRNAプラスミドを作成した後、メーカーの指示に従ってDH5-Alpha大腸菌でプラスミドを形質転換します。得られたクローンを、T3またはT7標準シーケンシングプライマーを用いて、サンガーシーケンシングで検証します。ドナープラスミドを作製するには、目的の配列を持つ二本鎖DNAを使用し、それをプラスミドBluesript 2SKネガティブマルチクローニングサイトに組み込みます。ドナープラスミドをシーケンシングして、sgRNAまたはPAM配列が正しく修飾され、プラスミドにSNPが存在しないことを確認します。次に、構築したgRNAとドナープラスミドを注入したCas9ハエを採取します。ハエに二酸化炭素を麻酔し、オスのハエと処女のメスを分離します。ハエの交配を確立するには、個々の狭いCTフードバイアルで、各Gゼロオスと少なくとも2匹のFM7Lバージンメスをペアにします。交差したバイアルを、摂氏25度、湿度60%に維持された通気孔付きインキュベーターに、F1が閉じるまで置きます。次に、麻酔をかけ、G zeroの男性と女性の両方の交配から少なくとも10匹の処女の女性の子孫を収集します。各F1フライに親子関係の詳細がタグ付けされ、別々に保存されていることを確認してください。PCR用のハエをスクリーニングするには、標的遺伝子の編集部位を囲む融解温度が摂氏約55度になるプライマーを設計します。各ハエサンプルの溶解バッファーを調製し、96ウェルPCRプレートの各ウェルに10マイクロリットルを分注します。脚の解剖プロセス中は、バッファーを低温に維持します。次に、ガラスキャピラリーチューブを準備し、一端にスクロース寒天食品を充填します。これらのチューブを、フライホテルと呼ばれる96ウェルの深さのウェルプレートに入れます。脚の解剖の場合は、二酸化炭素麻酔パッドを実体顕微鏡の下に置きます。候補のハエに麻酔をかけ、その真ん中の脚の1つを切断します。その後、脚を溶解緩衝液に浸します。一対の細かい金属製の鉗子でフライグライダーを持ちます。フライをフライホテルに移動し、すぐにチューブを糸で密封します。ハエのホテルは、摂氏25度、湿度60%に保たれた通気孔付きインキュベーターに入れます。切断した脚をサーマルサイクラーの溶解緩衝液に浸します。メーカーの指示に従って、1.5マイクロリットルのフライレッグライセートをDNAソースとして使用してPCR反応を整理します。PCR産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、バンドサイズに基づいて結果を解釈します。ゲルの結果に基づいて、フライホテルからポジティブフライを選択し、バランサーフライと個別に交配してF2世代を生成します。編集部位のサンガーシーケンシングにはホモ接合体ストックを使用し、正確性を確保します。検証済みのフライラインと野生型ハエを戻し交配し、バックグラウンド変異を除去します。シングルレッグPCRプロトコルを使用して各世代をスクリーニングします。ショウジョウバエの成虫の脳の共焦点顕微鏡画像は、深夜から早朝にかけて、目立たない核病巣に組織化された期間タンパク質を示しました。全体として、このプロトコルは、ジェノタイピングPCRプライマーが特異的である場合に頑健です。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

社会回避での定量化のための簡単​​なアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

で社会空間に影響を与える条件<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

でMARCMベースのクローンのMechanosensationための行動アッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

パスの長さのプロトコルを採餌<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

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大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

のシナプス変調を分析<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;長時間の光照射後の感光体

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...