Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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프로토콜 개발의 초기 단계에서 논의해 주신 George Watase와 Josie Clowney에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH(보조금 번호 R35GM133737 S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship(S. Y.) 및 McKnight Scholar Award(S. Y.)의 기금으로 지원되었습니다.

1. 유전자 편집 시약의 설계 및 구축
참고: 내인성 태깅을 수행하려면 원하는 유전자의 다양한 동형을 식별하는 것이 필수적입니다. 실험의 특정 목표에 따라 형광 태그를 내부적으로 또는 선택한 단백질 동형의 N- 또는 C-말단에 통합할 수 있습니다. 최적의 CRISPR 매개 편집을 위해서는 두 개의 sgRNA를 의도한 knock-in 부위에 적절하게 가깝게 배치하는 것이 중요합니다. 그 후, 상동...

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	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

이 결과는 초파리의 내인성 유전자를 태깅하기 위한 간소화되고 간단한 CRISPR 기반 전략을 보여줍니다. 프로토콜에서는 두 개의 gRNA를 사용하여 DNA 이중 가닥 절단과 상동 재조합을 보다 효율적으로 유도합니다. gRNA와 donor plasmid는 생식세포에서 Cas9 효소를 발현하는 초파리 배아에 주입됩니다. 이 배아는 이후 성체가 될 때까지 표준 조건에서 배양되며, 성인이 되면 밸런서파리와 교배되어 1...

형광 단백질은 살아있는 유기체 내 세포의 단백질 국소화, 역학 및 단백질-단백질 상호 작용을 시각화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다 1,2. 형광 단백질로 내인성 유전자를 태깅하면 세포 내 분해능으로 세포 과정의 장기 라이브 이미징이 가능합니다. 또한, 이러한 내인성 유전자 표지 기술은 과발현 및 면역염색 접근법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 단백질의 과발현은 단백질 잘못 접힘, 비특이적 단백질-단백질 상호작용 및 잘못된 국소화를 유발할 수 있다3. 현재까지 연구자들은 효율적인 상동 재조합을 겪을 수 있는 신진 효모와 같은 몇 가지 모델 유기체를 위해 형광 단백질에 융합된 내인성 유전자의 방대한 라이브러리를 만들 수 있었다4. Drosophila melanogaster의 경우, 유전자를 형광 태깅하기 위해 MiMICs5, transposon 기반 enhancer traps6 및 fosmids7과 같은 다양한 도구가 고안되었습니다.
CRISPR-Cas9 기반 도구의 개발로 광범위한 모델 유기체 8,9에서 내인성 단백질 태깅을 포함한 게놈 편집을 효율적으로 수행할 수 있게 되었습니다. Cas9은 매우 효율적이고 특이적인 방식으로 이중 가닥 DNA를 절단하는 RNA 유도 효소입니다.8 그런 다음 점 돌연변이 또는 결실로 이어지는 비상동 말단 결합(NHEJ) 경로에 의해 복구될 수 있습니다. 대안적으로, 상동성 유도 복구(homology-directed repair, HDR) 경로는 이종 DNA를 염색체에 통합할 수 있도록 합니다.
모델 유기체인 Drosophila melanogaster에서 CRISPR 기반 유전자 태깅을 위한 과거의 방법은 2단계 프로세스 10,11,12에 의존했습니다. 여기에는 식별 가능한 눈 색깔 마커인 Dsred를 사용하여 성공적인 HDR 이벤트를 감지하는 작업이 포함됩니다. 그 후, Dsred 마커는 Cre/loxP 재조합 시스템을 사용하여 절제됩니다. 이 프로세스를 간소화하고 신속하게 처리하기 위해 여기서는 더 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 치명적인 유전형 분석의 필요성을 피하고 개별 파리를 직접 스크리닝할 수 있습니다. 특히, PCR 기반 접근법을 사용하여 파리의 중간 다리의 작은 부분에서 DNA를 추출하여 개별 파리의 유전자형을 분석할 수 있습니다. 주목할 만한 점은, 이 절차는 표본을 채취한 파리의 활력, 움직임 또는 번식 능력을 손상시키지 않는다는 것입니다. 이 방법을 통해 식별된 적절한 개인만이 안정적인 주식으로 더욱 발전합니다.
여기에서는 형광 리포터로 내인성 유전자를 표지하는 형광 단백질 표지 파리를 생성하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 사용하여 원하는 형광단 태그를 내인성 유전자의 N 또는 C 말단에 융합합니다. 아래에서는 gRNA 플라스미드와 donor plasmid의 설계 및 구성, CRISPR 양성 파리를 선별하기 위한 원스텝 스크리닝 전략, 안정적인 계통을 확립하기 위한 단계에 대해 설명합니다. 구체적으로, 내인성 코어 클럭 초파리 유전자(endogenous core clock Drosophila gene, period)에 C-말단의 형광단(fluorophore)을 태그하는 전략을 설명합니다. 또한 태그된 단백질이 기능적인지 확인하기 위해 수행해야 하는 대조군 실험과 온전한 초파리 뇌 내의 생체 시계 뉴런에서 기간 단백질을 시각화하기 위한 라이브 이미징 기술에 대해 간략하게 설명합니다13. 여기에 설명된 프로토콜은 CRISPR-Cas9 게놈 편집에 의한 DNA의 특정 비트의 삭제 및 삽입을 위한 후보 물질 스크리닝에도 광범위하게 적용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

살아있는 세포에 있는 단백질 subcellular 국소화, 동역학 및 규칙에 대한 학문은 형광 융합 단백질을 생성하기 위하여 내인성 유전자의 표를 붙이는 것을 허용하는 기술의 출현에 의해 근본적으로 변형되었습니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 단백질 거동을 실시간으로 시각화하여 세포 환경 내에서 단백질의 기능과 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 현재 많은 유전자 태그 연구는 첫 번째 단계에서 눈 색깔 변화와 같은 가시 마커를 사용하여 유전자 변형 유기체를 식별하고 두 번째 단계에서 가시 마커를 제거하는 2단계 프로세스를 사용합니다. 여기에서는 눈에 보이는 아이 마커 없이 조작된 라인을 스크리닝할 수 있는 Drosophila melanogaster에서 정확하고 신속한 내인성 유전자 태깅을 수행하기 위한 원스텝 프로토콜을 제시하여 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 성공적인 유전자 태그 부착 이벤트를 스크리닝하기 위해 PCR 기반 기술을 사용하여 중간 다리의 작은 부분을 분석하여 개별 파리의 유전자형을 분석합니다. 스크리닝 기준을 통과한 파리는 안정적인 주식을 생산하는 데 사용됩니다. 여기에서는 CRISPR 편집 플라스미드의 설계 및 구성과 엔지니어링 라인의 스크리닝 및 확인 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 Drosophila 에서 내인성 유전자 태깅의 효율성을 크게 향상시키고 생체 내 세포 과정 연구를 가능하게 합니다.

우리의 실험에서, 우리는 일반적으로 모든 염색체 (X, II, III)에서 다양한 내인성 태그 유전자 스크리닝에서 ~ 20 % -30 %의 성공률을 발견했습니다. 이 공정의 효율성은 gRNA 선택, 유전자의 특성 및 주입 품질과 같은 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에서는 내인성 기간 유전자에 mNeonGreen 형광단13을 태그하는 전략의 결과를 설명합니다. D. ...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

여기에서는 성공적인 유전자 변형의 마커 없는 식별을 위해 PCR 기반 기술을 활용하여 안정적인 knock-in 라인의 개발을 촉진하는 초파리에 대한 단순화된 내인성 유전자 태깅 프로토콜을 제시합니다.

Drosophila melanogaster의 내인성 유전자 태깅을 위한 원스텝 CRISPR 기반 전략

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

이 프로토콜의 목적은 내인성 편집 플라이 라인을 생성하는 것입니다. 형광 단백질 knock-in을 예로 들었지만, 다른 knock-in, knockout 및 돌연변이 생성에도 적용할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 CRISPR 상동 재조합 기반 방법이므로 돌연변이 부위에 대한 제한이 거의 없습니다.또한, 당사의 프로토콜은 유전형 분석 단계와 관련된 시간과 노력을 크게 줄였습니다. 먼저 fly CRISPR 웹사이트를 열어 Drosophila용 sgRNA를 설계하고 원하는 knock-in 위치를 둘러싼 약 100개의 염기쌍 염기서열을 입력합니다. 5가지 프라임 구아닌 옵션으로 CRISPR 표적을 선택합니다.CRISPR 타겟 찾기 버튼을 클릭하여 가능한 sgRNA 염기서열 목록을 생성합니다. 그런 다음 각 염기서열에 대한 평가 버튼을 클릭하고 off-target이 0인 두 개의 sgRNA를 선택합니다. 천연 단백질 발현 수준은 일반적으로 훨씬 낮기 때문에 밝고 광안정성이 있으며 실험 설정에 맞는 형광 태그를 선택하십시오.다음으로, 생화학 분석을 위해 epitope tag를 형광 마커에 연결하는 링커를 설계합니다. 글리신과 세린과 같은 아미노산으로 구성된 2개에서 20개의 아미노산 범위의 링커 펩타이드를 사용하십시오. 초파리(Drosophila)의 donor 벡터를 설계하려면 링커 펩타이드와 형광 태그의 DNA 염기서열을 구성하고 양쪽 말단 측면에 상동 염기서열을 보장합니다.donor plasmid 내의 PAM 염기서열을 수정하여 생성된 단백질 아미노산 염기서열을 유지합니다. 다음으로, 태그 위치에 따라 시작 및 중지 코돈의 위치를 지정합니다. 내부 태깅의 경우 형광 태그가 표적 유전자의 코딩 서열과 함께 프레임에 있는지 확인합니다.N-말단 태깅의 경우, 내인성 시작 코돈 뒤에 형광 태크를 배치합니다. C-말단 태깅의 경우, 형광 태깅을 자연 정지 코돈 앞에 놓습니다. 잠재적인 번역 문제를 피하기 위해 단일 시작 코돈만 유지해야 합니다.선택적 제한 효소 기반 클로닝 접근법을 사용하여 sgRNA 염기서열을 플라스미드 U6 Bbs1-chiRNA 플라스미드에 삽입합니다. sgRNA 플라스미드를 생성한 후 제조업체의 지침에 따라 DH5-Alpha Escherichia coli의 플라스미드를 형질전환시킵니다. T3 또는 T7 표준 염기서열분석 프라이머를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 통해 결과 클론을 검증합니다.donor plasmid를 생성하려면 원하는 염기서열을 가진 double-stranded DNA를 사용하여 plasmid Bluesript 2SK negative multiple cloning site에 통합합니다. donor plasmid의 염기서열을 분석하여 sgRNA 또는 PAM 염기서열이 올바르게 수정되고 plasmid에 SNP가 존재하지 않도록 합니다. 다음으로, 구성된 gRNA와 donor plasmid를 주입한 Cas9 파리를 채취합니다.파리를 이산화탄소로 마취시키고 수컷 파리와 처녀 암컷을 분리합니다. 플라이 크로스를 설정하려면 각 G zero 수컷을 개별 좁은 CT 식품 바이알에 최소 2개의 FM7L 처녀 암컷과 짝을 이룹니다. F1이 근접할 때까지 섭씨 25도, 습도 60%로 유지되는 통풍이 잘되는 인큐베이터에 교차된 바이알을 넣습니다.그런 다음 G 0 남성과 여성 교배종에서 최소 10 마리의 처녀 여성 자손을 마취하고 수집하십시오. 각 F1 파리에 혈통의 세부 정보가 태그로 지정되고 별도로 저장되는지 확인하십시오. PCR을 위해 파리를 스크리닝하려면 표적 유전자의 편집 부위를 포함하는 약 섭씨 55도의 용융 온도로 프라이머를 설계합니다.각 플라이 샘플에 대한 용해 완충액을 준비하고 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10마이크로리터를 분주합니다. 다리 절개 과정 동안 완충액을 차가운 온도로 유지하십시오. 다음으로, 유리 모세관을 준비하고 한쪽 끝을 자당 한천 음식으로 채웁니다.이 튜브를 플라이 호텔이라고 하는 96웰 깊이의 웰 플레이트에 놓습니다. 다리 절제의 경우 이산화탄소 마취 패드를 실체 현미경 아래에 놓습니다. 후보 파리를 마취시키고 가운데 다리 중 하나를 절단합니다.그런 다음 다리를 용해 완충액에 담그십시오. 한 쌍의 미세한 금속 집게로 플라이 윙을 잡습니다. 플라이를 플라이 호텔로 옮기고 즉시 실로 튜브를 밀봉하십시오.섭씨 25도, 습도 60%로 유지되는 통풍이 잘되는 인큐베이터에 플라이 호텔을 수용하십시오. 절단된 다리를 열 순환기의 용해 완충 용액에 담그십시오. 1.5 마이크로리터의 플라이 레그 용해물을 DNA 소스로 사용하여 제조업체의 지시에 따라 PCR 반응을 구성합니다.PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동에 적용하고 밴드 크기에 따라 결과를 해석합니다. 겔 결과를 바탕으로 플라이 호텔에서 양성 파리를 선택하고 밸런서 파리와 개별적으로 교배하여 F2 세대를 생성합니다. 정확성을 보장하기 위해 편집 부위의 Sanger 염기서열분석에 동형접합 스톡을 사용합니다.배경 돌연변이를 제거하기 위해 야생형 파리와 백크로스 검증된 플라이 라인. 단일 다리 PCR 프로토콜을 사용하여 각 세대를 스크리닝합니다. 성인 초파리 뇌의 컨포칼 현미경 이미지는 늦은 밤과 이른 아침 시간대에 걸쳐 신중한 핵 병소로 조직된 생리 단백질을 보여주었습니다.전반적으로, 이 프로토콜은 유전형 분석 PCR 프라이머가 특이적인 경우 강력합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

연구

신경과학

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

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의 자발적인 운동 활성의 결정<em&gt; 초파리</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

사회 회피의 정량화에 대한 간단한 분석<em&gt; 초파리</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

사회적 공간에 영향을 미치는 조건<em&gt; 초파리</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

에서 냄새 유도 행동의 고해상도 정량화<em&gt; 초파리</em사용&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; 패러다임

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

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의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반<em&gt; 초파리</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

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대한 꼴 경로 길이 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 애벌레

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

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모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

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간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

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의 시냅틱 변조 분석<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 장시간 빛에 노출 후 광수

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...