Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Vi takker George Watase og Josie Clowney for diskusjoner i de innledende stadiene av protokollutviklingen. Arbeidet ble støttet av midler fra NIH (stipend nr. R35GM133737 til SY), Alfred P. Sloan Fellowship (til SY) og McKnight Scholar Award (til SY).

1. Design og konstruksjon av genredigeringsreagenser
MERK: For å utføre endogen merking er det viktig å identifisere de forskjellige isoformene av det ønskede genet. Avhengig av de spesifikke målene for forsøket, kan en fluorescerende tag inkorporeres enten internt eller ved N- eller C-terminalen til den valgte proteinisoformen (e). For optimal CRISPR-mediert redigering er det avgjørende å plassere de to sgRNA-ene passende nær det tiltenkte innslagsstedet. Deretter, for å muliggjøre r...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

Resultatene demonstrerer en strømlinjeformet, enkel ett-trinns CRISPR-basert strategi for merking av endogene gener i Drosophila. I protokollen bruker vi to gRNA for å indusere DNA-dobbeltstrengbrudd og homolog rekombinasjon mer effektivt. GRNAene og donorplasmidet injiseres i bananflueembryoer, som uttrykker Cas9-enzymet i kimlinjen. Disse embryoene dyrkes deretter under standardbetingelser til voksen alder, da de krysses med balansefluer for å produsere første generasjons (F1) avkom. PCR-genotyping utføre...

Fluorescerende proteiner har dukket opp som kraftige verktøy for å visualisere proteinlokalisering, dynamikk og protein-protein-interaksjoner i celler i levende organismer 1,2. Merking av endogene gener med fluorescerende proteiner muliggjør langsiktig levende avbildning av cellulære prosesser med subcellulær oppløsning. Videre har disse endogene genmerkingsteknikkene flere fordeler sammenlignet med overekspresjon og immunfargingsmetoder. For eksempel kan overekspresjon av proteiner føre til feilfolding av proteiner, uspesifikke protein-protein-interaksjoner og feillokalisering3. Hittil har forskere vært i stand til å skape store biblioteker av endogene gener smeltet til fluorescerende proteiner for noen modellorganismer, for eksempel spirende gjær, som kan gjennomgå effektiv homolog rekombinasjon4. Når det gjelder Drosophila melanogaster, har forskjellige verktøy som MiMICs5, transposonbaserte forsterkerfeller6 og fosmider7 blitt utviklet for å fluorescerende merke gener.
Utviklingen av CRISPR-Cas9-baserte verktøy har gjort det mulig å effektivt utføre genomredigering, inkludert merking av endogene proteiner, i et bredt spekter av modellorganisme 8,9. Cas9 er et RNA-styrt enzym som spalter dobbeltstrenget DNA på en svært effektiv og spesifikk måte8, som deretter kan repareres av en ikke-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) -vei som fører til punktmutasjoner eller delesjoner. Alternativt tillater den homologirettede reparasjonsveien (HDR) integrering av heterologt DNA i kromosomet.
Tidligere metoder for CRISPR-basert genmerking i modellorganismen, Drosophila melanogaster, har basert seg på en to-trinns prosess 10,11,12. Dette innebærer å bruke en merkbar øyenfargemarkør, Dsred, for å oppdage vellykkede HDR-hendelser. Etterpå ville Dsred-markøren bli skåret ut ved hjelp av Cre/loxP-rekombinasjonssystemet. For å effektivisere og fremskynde denne prosessen, presenterer vi her en enklere og mer effektiv metode. Denne tilnærmingen omgår behovet for dødelig genotyping og muliggjør direkte screening av individuelle fluer. Spesielt bruker vi en PCR-basert tilnærming for å trekke ut DNA fra et lite segment av fluens midtben, slik at vi kan genotype individuelle fluer. Spesielt kompromitterer denne prosedyren ikke vitaliteten, bevegelsen eller reproduksjonsevnen til den samplede fluen. Bare de aktuelle individene, identifisert gjennom denne metoden, videreutvikles til stabile bestander.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for generering av fluorescerende proteinmerkede fluer der endogene gener er merket med fluorescerende reportere. Denne teknikken bruker CRISPR-Cas9-genomredigering for å smelte enhver ønsket fluoroforkode til N- eller C-terminalen til et endogent gen. Nedenfor beskriver vi design og konstruksjon av gRNA-plasmider og et donorplasmid, ett-trinns screeningstrategi for å velge CRISPR-positive fluer, og trinn for å etablere stabile linjer. Spesielt beskriver vi strategier for å merke et endogent kjerneklokke Drosophila-gen, periode, med en fluorofor ved C-terminalen. Vi beskriver også kort kontrolleksperimentene som må utføres for å bekrefte at det merkede proteinet er funksjonelt og live-imaging teknikker for å visualisere periodeproteinet i levende klokkenevroner i intakte Drosophila-hjerner 13. Protokollen beskrevet her er også bredt anvendelig for screeningskandidater for slettinger og innsettinger av spesifikke biter av DNA ved CRISPR-Cas9-genomredigering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

Studien av protein subcellulær lokalisering, dynamikk og regulering i levende celler har blitt dypt forvandlet ved bruk av teknikker som tillater merking av endogene gener for å produsere fluorescerende fusjonsproteiner. Disse metodene gjør det mulig for forskere å visualisere proteinadferd i sanntid, og gir verdifull innsikt i deres funksjoner og interaksjoner i det cellulære miljøet. Mange nåværende genmerkingsstudier benytter en to-trinns prosess der synlige markører, for eksempel øyenfargeendringer, brukes til å identifisere genetisk modifiserte organismer i første trinn, og den synlige markøren blir skåret ut i det andre trinnet. Her presenterer vi en ett-trinns protokoll for å utføre presis og rask endogen genmerking i Drosophila melanogaster, som muliggjør screening for konstruerte linjer uten den synlige øyemarkøren, noe som gir en betydelig fordel i forhold til tidligere metoder. For å screene for vellykkede genmerkingshendelser, bruker vi en PCR-basert teknikk for å genotype individuelle fluer ved å analysere et lite segment fra mellombenet. Fluer som passerer screeningkriteriene brukes deretter til å produsere stabile bestander. Her beskriver vi design og konstruksjon av CRISPR-redigeringsplasmider og metoder for screening og bekreftelse av konstruerte linjer. Sammen forbedrer denne protokollen effektiviteten av endogen genmerking i Drosophila betydelig og muliggjør studier av cellulære prosesser in vivo.

I våre eksperimenter fant vi vanligvis en suksessrate på ~ 20% -30% i screening for ulike endogene merkede gener på alle kromosomer (X, II, III). Effektiviteten av denne prosessen kan variere basert på flere faktorer, for eksempel gRNA-seleksjon, genets natur og injeksjonskvalitet. Her illustrerer vi resultatene fra vår strategi for å merke det endogene periodegenet med mNeonGreen-fluoroforen13. Periodegenet , plassert på X-kromosomet til <...

Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Her presenterer vi en forenklet endogen genmerkingsprotokoll for Drosophila, som benytter en PCR-basert teknikk for markørfri identifisering av vellykkede genetiske modifikasjoner, noe som letter utviklingen av stabile innslagslinjer.

Ett-trinns CRISPR-basert strategi for endogen genmerking i Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Hensikten med denne protokollen er å generere et endogent redigert fluesnøre. Vi viser en fluorescerende protein knock-in som et eksempel, men det kan også brukes til andre knock-in, knockout, samt mutasjonsgenerering. Vår protokoll er en CRISPR homolog rekombinasjonsbasert metode, så det er nesten ingen begrensning på mutasjonssteder.Videre reduserte protokollen vår tid og krefter involvert i genotypingstrinn. For å begynne, åpne fly CRISPR-nettstedet for å designe sgRNA for Drosophila, og skriv inn omtrent 100 baseparsekvenser rundt ønsket innslagssted. Velg CRISPR-mål med alternativet fem prime guanin.Klikk på knappen finn CRISPR-mål for å generere en liste over mulige sgRNA-sekvenser. Klikk deretter på evaluereknappen for hver sekvens, og velg to sgRNA som har null off-targets. Siden de naturlige proteinuttrykksnivåene vanligvis er mye lavere, velg fluorescerende koder som er lyse og fotostabile, og passer til det eksperimentelle oppsettet.Deretter designer du en linker for å koble epitopkoder til fluorescerende markør for biokjemisk analyse. Bruk et linkerpeptid som spenner fra to til 20 aminosyrer, bestående av aminosyrer som glycin og serin. For å designe donorvektoren for Drosophila, organiser DNA-sekvensen av linkerpeptidet og fluorescerende taggen, og sørg for homologe sekvenser som flankerer begge ender.Endre eventuelle PAM-sekvenser i donorplasmidet for å opprettholde den resulterende proteinaminosyresekvensen. Deretter plasserer du start- og stoppkodonene avhengig av merkeplasseringen. For intern merking, sørg for at fluorescerende tag er i ramme med kodingssekvensen til målgenet.For N-terminalmerking plasserer du fluorescerende tag etter det endogene startkodonet. For merking med C-terminal, plasser fluorescerende tag før det naturlige stoppkodonet. Sørg for å beholde bare et enkelt startkodon for å unngå potensielle oversettelsesproblemer.Bruk den alternative restriksjonsenzymbaserte kloningsmetoden for å sette inn sgRNA-sekvensen i plasmidet U6 Bbs1-chiRNA-plasmidet. Etter å ha opprettet sgRNA-plasmidet, transformer plasmidet i DH5-Alpha Escherichia coli i henhold til produsentens instruksjoner. Bekreft de resulterende klonene gjennom Sanger-sekvensering, ved hjelp av enten T3 eller T7 standard sekvenseringsprimere.For å lage donorplasmidet, bruk dobbeltstrenget DNA med ønsket sekvens, og integrer det i plasmid Bluesript 2SK negativt multippel kloningssted. Sekvenser donorplasmidet for å sikre at sgRNA- eller PAM-sekvenser er korrekt modifisert og at det ikke er noen SNPer tilstede i plasmidet. Deretter tar du Cas9-fluer injisert med de konstruerte gRNA- og donorplasmidene.Bedøv fluene med karbondioksid, og skille mannlige fluer og jomfruhunner. For å etablere fluekryss, par hver G null hann med minst to FM7L jomfruhunner i individuelle smale CT-matflasker. Plasser kryssede hetteglass i en ventilert inkubator opprettholdt ved 25 grader Celsius og 60% fuktighet til F1-fluer lukker.Deretter bedøves og samle minst 10 jomfru kvinnelige avkom fra både G null mannlige og kvinnelige kryss. Forsikre deg om at hver F1-flue er merket med detaljer om foreldreskapet og lagret separat. For å skjerme fluer for PCR, design primere med en smeltetemperatur på rundt 55 grader Celsius som omfatter redigeringsstedet til målgenet.Forbered lysisbuffer for hver flueprøve, og dispenser 10 mikroliter i hver brønn på en 96 brønns PCR-plate. Oppretthold bufferen ved en kald temperatur under bendisseksjonsprosessen. Deretter tilbereder du glasskapillærrør, fyll den ene enden med sukrose agarmat.Plasser disse rørene i en 96 brønn dyp brønnplate, referert til som fly hotel. For bendisseksjon, plasser karbondioksidbedøvelsesputen under et stereomikroskop. Bedøv en kandidatflue, og kutt et av midtbena.Deretter senker du benet ned i lysisbufferen. Hold fluevingen med et par fine metalltang. Flytt flua til fluehotellet, og forsegl tuben med garn umiddelbart.Hus fluehotellet i en ventilert inkubator opprettholdt ved 25 grader Celsius og 60% fuktighet. Senk de avskårne bena i lysisbufferløsningen i en termisk syklist. Organiser PCR-reaksjonen som instruert av produsenten, ved å bruke 1,5 mikroliter av fluebenlysatet som DNA-kilde.Utsett PCR-produktene for agarosegelelektroforese, og tolk resultatene basert på båndstørrelse. Basert på gelresultatene, velg de positive fluene fra fluehotellet og kryss dem individuelt med balanserfluer for å produsere F2-generasjonen. Bruk homozygote aksjer for Sanger-sekvensering av redigeringsstedet for å sikre nøyaktighet.Back-cross validerte fluelinjer med vill type fluer for å fjerne bakgrunnsmutasjoner. Skjerm hver generasjon ved hjelp av PCR-protokollen med ett ben. Konfokale mikroskopbilder av voksne Drosophila-hjerner viste periodeprotein organisert i diskrete nukleære foci gjennom sen kveld og tidlig morgen.Samlet sett er denne protokollen robust hvis dine genotyping PCR-primere er spesifikke.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulering av Escape Behavior i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Fastsettelse av Spontan Locomotor aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Enkel analyse for Kvantifisering av Social Avhold i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Forhold som påvirker sosiale rom i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Høyoppløselig Kvantifisering av Lukt styrt Atferd<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bruke<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

En Behavioral analyse for Mechanosensation av MARCM baserte Clones i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Sti lengde Protokoll for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

Kapillær mater analysen Måler matinntak i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analysere Synaptic Modulation av<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreseptorer etter eksponering for Langvarig lys

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...