Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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Agradecemos a George Watase e Josie Clowney pelas discussões durante os estágios iniciais de desenvolvimento do protocolo. O trabalho foi apoiado por fundos do NIH (grant no. R35GM133737 para S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (para S. Y.) e McKnight Scholar Award (para S. Y.).

1. Projeto e construção de reagentes de edição gênica
NOTA: Para realizar a marcação endógena, é essencial identificar as várias isoformas do gene desejado. Dependendo dos objetivos específicos do experimento, um tag fluorescente pode ser incorporado internamente ou no termini N ou C da(s) isoforma(s) de proteína selecionada(s). Para uma edição mediada por CRISPR ideal, é crucial posicionar os dois sgRNAs adequadamente perto do local de knock-in pretendido. Posteriormente, para pe...

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	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

Os resultados demonstram uma estratégia simplificada e simples baseada em CRISPR de uma etapa para marcar genes endógenos em Drosophila. No protocolo, usamos dois gRNAs para induzir a quebra da fita dupla do DNA e a recombinação homóloga de forma mais eficiente. Os gRNAs e o plasmídeo doador são injetados em embriões de moscas-das-frutas, que expressam a enzima Cas9 em sua linha germinativa. Esses embriões são posteriormente cultivados em condições padrão até a idade adulta, quando são cruzados co...

As proteínas fluorescentes têm emergido como poderosas ferramentas para visualizar a localização, a dinâmica e as interações proteína-proteína em células de organismos vivos 1,2. A marcação de genes endógenos com proteínas fluorescentes permite imagens ao vivo de longo prazo de processos celulares com resolução subcelular. Além disso, essas técnicas endógenas de marcação gênica apresentam diversas vantagens em relação às abordagens de superexpressão e imunomarcação. Por exemplo, a superexpressão de proteínas pode levar a enovelamento incorreto de proteínas, interações proteína-proteína inespecíficas e localização incorreta3. Até o momento, os pesquisadores conseguiram criar vastas bibliotecas de genes endógenos fundidos a proteínas fluorescentes para alguns organismos modelo, como leveduras em brotamento, que podem sofrer eficiente recombinação homóloga4. No caso de Drosophila melanogaster, várias ferramentas, como MiMICs5, armadilhas intensificadoras baseadas em transposon6 e fosmidas7, foram desenvolvidas para marcar genes fluorescentemente.
O desenvolvimento de ferramentas baseadas em CRISPR-Cas9 tornou possível realizar eficientemente a edição do genoma, incluindo a marcação de proteínas endógenas, em uma ampla gama de organismos modelo 8,9. Cas9 é uma enzima guiada por RNA que cliva DNA de fita dupla de maneira altamente eficiente e específica8, que pode então ser reparada por uma via de junção final não homóloga (NHEJ) levando a mutações pontuais ou deleções. Alternativamente, a via de reparo dirigido por homologia (HDR) permite a integração do DNA heterólogo no cromossomo.
Métodos anteriores para marcação gênica baseada em CRISPR no organismo modelo, Drosophila melanogaster, basearam-se em um processo de duas etapas 10,11,12. Isso envolve o uso de um marcador de cor de olho discernível, Dsred, para detectar eventos HDR bem-sucedidos. Posteriormente, o marcador Dsred seria excisado usando o sistema de recombinação Cre/loxP. Para agilizar e agilizar esse processo, apresentamos aqui um método mais simples e eficiente. Essa abordagem contorna a necessidade de genotipagem letal e permite a triagem direta de moscas individuais. Especificamente, empregamos uma abordagem baseada em PCR para extrair DNA de um pequeno segmento da perna média da mosca, permitindo-nos genotipar moscas individuais. Notavelmente, este procedimento não compromete a vitalidade, o movimento ou as capacidades reprodutivas da mosca amostrada. Apenas os indivíduos apropriados, identificados através deste método, são desenvolvidos em estoques estáveis.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para geração de moscas marcadas com proteínas fluorescentes em que genes endógenos são marcados com repórteres fluorescentes. Esta técnica usa a edição do genoma CRISPR-Cas9 para fundir qualquer etiqueta de fluoróforo desejada ao terminal N- ou C- de um gene endógeno. Abaixo, descrevemos o projeto e a construção de plasmídeos de gRNA e de um plasmídeo doador, a estratégia de triagem em uma etapa para selecionar moscas CRISPR-positivas e as etapas para estabelecer linhagens estáveis. Especificamente, descrevemos estratégias para marcar um gene endógeno do relógio central Drosophila, ponto, com um fluoróforo no C-terminal. Também descrevemos brevemente os experimentos de controle que precisam ser realizados para confirmar que a proteína marcada é funcional e técnicas de imagem ao vivo para visualizar a proteína Period em neurônios de relógio vivos dentro de cérebros intactos de Drosophila 13. O protocolo descrito aqui também é amplamente aplicável para selecionar candidatos para deleções e inserções de pedaços específicos de DNA por edição do genoma CRISPR-Cas9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

O estudo da localização, dinâmica e regulação de proteínas subcelulares em células vivas tem sido profundamente transformado pelo advento de técnicas que permitem a marcação de genes endógenos para produzir proteínas de fusão fluorescente. Esses métodos permitem que os pesquisadores visualizem o comportamento das proteínas em tempo real, fornecendo informações valiosas sobre suas funções e interações dentro do ambiente celular. Muitos estudos atuais de marcação genética empregam um processo de duas etapas em que marcadores visíveis, como alterações na cor dos olhos, são usados para identificar organismos geneticamente modificados na primeira etapa, e o marcador visível é excisado na segunda etapa. Aqui, apresentamos um protocolo de uma etapa para realizar marcação gênica endógena precisa e rápida em Drosophila melanogaster, que permite a triagem de linhagens projetadas sem o marcador ocular visível, oferecendo uma vantagem significativa em relação aos métodos anteriores. Para rastrear eventos bem-sucedidos de marcação genética, empregamos uma técnica baseada em PCR para genotipar moscas individuais analisando um pequeno segmento de sua perna média. As moscas que passam nos critérios de triagem são então usadas para produzir estoques estáveis. Aqui, detalhamos o projeto e a construção de plasmídeos de edição CRISPR e métodos para triagem e confirmação de linhas de engenharia. Em conjunto, este protocolo melhora significativamente a eficiência da marcação gênica endógena em Drosophila e possibilita estudos de processos celulares in vivo.

Em nossos experimentos, tipicamente encontramos uma taxa de sucesso de ~20%-30% na triagem de vários genes marcados endógenos em todos os cromossomos (X, II, III). A eficiência desse processo pode variar com base em vários fatores, como a seleção do gRNA, a natureza do gene e a qualidade da injeção. Aqui, ilustramos os resultados de nossa estratégia de marcar o gene do período endógeno com o fluoróforo mNeonGreen13. O gene do período ...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Aqui, apresentamos um protocolo simplificado de marcação gênica endógena para Drosophila, que utiliza uma técnica baseada em PCR para identificação livre de marcadores de modificações genéticas bem-sucedidas, facilitando o desenvolvimento de linhagens estáveis.

Estratégia baseada em CRISPR em uma etapa para marcação gênica endógena em Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

O objetivo deste protocolo é gerar uma linha de mosca editada endógena. Mostramos uma proteína fluorescente knock-in como exemplo, mas ela também pode ser aplicada a outros knock-in, knockout, bem como geração de mutação. Nosso protocolo é um método baseado em recombinação homóloga CRISPR, portanto, quase não há restrição nos locais de mutação.Além disso, nosso protocolo reduziu muito o tempo e o esforço envolvidos nas etapas de genotipagem. Para começar, abra o site CRISPR da fly para projetar sgRNAs para Drosophila e insira aproximadamente 100 sequências de pares de base em torno do local desejado. Selecione alvos CRISPR com a opção de guanina cinco prime.Clique no botão localizar alvos CRISPR para gerar uma lista de possíveis sequências de sgRNA. Em seguida, clique no botão avaliar para cada sequência e escolha dois sgRNAs que tenham zero off-targets. Como os níveis de expressão de proteína natural são tipicamente muito mais baixos, selecione etiquetas fluorescentes que sejam brilhantes e fotoestáveis e se encaixe na configuração experimental.Em seguida, projete um linker para vincular etiquetas de epítopos ao marcador fluorescente para análise bioquímica. Use um peptídeo ligante que varia de dois a 20 aminoácidos, compreendendo aminoácidos como glicina e serina. Para projetar o vetor doador para Drosophila, organize a sequência de DNA do peptídeo ligante e da etiqueta fluorescente, e garanta sequências homólogas flanqueando ambas as extremidades.Modificar quaisquer sequências PAM dentro do plasmídeo doador para manter a sequência de aminoácidos de proteínas resultantes. Em seguida, posicione os códons de início e parada dependendo do local da tag. Para marcação interna, certifique-se de que a etiqueta fluorescente esteja no quadro com a sequência codificadora do gene alvo.Para a marcação N-terminal, posicione o tag fluorescente após o códon de início endógeno. Para a marcação C-terminus, posicione a etiqueta fluorescente antes do códon de parada natural. Certifique-se de manter apenas um único códon inicial para evitar possíveis problemas de tradução.Use a abordagem alternativa de clonagem baseada em enzimas de restrição para inserir a sequência de sgRNA no plasmídeo U6 Bbs1-chiRNA. Depois de criar o plasmídeo de sgRNA, transforme o plasmídeo em DH5-Alpha Escherichia coli de acordo com as instruções do fabricante. Verifique os clones resultantes por meio do sequenciamento de Sanger, usando primers de sequenciamento padrão T3 ou T7.Para criar o plasmídeo doador, use DNA de fita dupla com a sequência desejada e integre-o ao sítio de clonagem múltipla do plasmídeo Bluesript 2SK negativo. Sequenciar o plasmídeo doador para garantir que as sequências de sgRNA ou PAM sejam modificadas corretamente e não haja SNPs presentes no plasmídeo. Em seguida, tome moscas Cas9 injetadas com o gRNA construído e plasmídeos doadores.Anestesiar as moscas com dióxido de carbono e separar moscas machos e fêmeas virgens. Para estabelecer cruzamentos de moscas, emparelhe cada macho G zero com pelo menos duas fêmeas virgens FM7L em frascos de alimento CT estreitos individuais. Coloque frascos cruzados em uma incubadora ventilada mantida a 25 graus Celsius e 60% de umidade até que as moscas F1 se fechem.Em seguida, anestesiar e coletar pelo menos 10 filhotes fêmeas virgens de ambos os cruzamentos G zero macho e fêmea. Certifique-se de que cada mosca de F1 seja marcada com os detalhes de sua filiação e armazenada separadamente. Para rastrear moscas para PCR, projete primers com uma temperatura de fusão de cerca de 55 graus Celsius que abrangem o local de edição do gene alvo.Prepare o tampão de lise para cada amostra de mosca e distribua 10 microlitros em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Mantenha o tampão a uma temperatura fria durante o processo de dissecção da perna. Em seguida, prepare tubos capilares de vidro, enchendo uma extremidade com alimento de ágar sacarose.Coloque esses tubos em uma placa de poço profundo de 96 poços, conhecida como o hotel da mosca. Para a dissecção da perna, posicione a almofada de anestesia de dióxido de carbono sob um microscópio estéreo. Anestesiar uma mosca candidata e cortar uma de suas pernas do meio.Depois disso, mergulhe a perna no tampão de lise. Segure a asa de mosca com um par de pinças finas de metal. Mova a mosca para o fly hotel e sele o tubo com fios imediatamente.Hospede o hotel de moscas em uma incubadora ventilada mantida a 25 graus Celsius e 60% de umidade. Submergir as pernas decepadas na solução tampão de lise em um termociclador. Organizar a reação de PCR conforme as instruções do fabricante, usando 1,5 microlitros de lisado da perna de mosca como fonte de DNA.Submeter os produtos de PCR à eletroforese em gel de agarose e interpretar os resultados com base no tamanho da banda. Com base nos resultados do gel, selecione as moscas positivas do hotel de moscas e cruze-as individualmente com moscas balanceadoras para produzir a geração F2. Use estoques homozigotos para o sequenciamento Sanger do site de edição para garantir a precisão.Retrocruzamento de linhas de moscas validadas com moscas selvagens para remover mutações de fundo. Rastreie cada geração usando o protocolo de PCR de perna única. Imagens de microscópio confocal de cérebros adultos de Drosophila mostraram proteínas menstruais organizadas em focos nucleares discretos ao longo da noite e início da manhã.No geral, esse protocolo é robusto se os primers de PCR de genotipagem forem específicos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

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Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neurociência

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

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Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

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Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

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De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

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