Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
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Agradecemos a George Watase y Josie Clowney por las discusiones durante las etapas iniciales del desarrollo del protocolo. El trabajo fue financiado por fondos de los NIH (subvención n.º R35GM133737 a S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (a S. Y.) y McKnight Scholar Award (a S. Y.).

1. Diseño y construcción de reactivos de edición génica
NOTA: Para llevar a cabo el marcaje endógeno, es imprescindible identificar las distintas isoformas del gen deseado. Dependiendo de los objetivos específicos del experimento, se puede incorporar una etiqueta fluorescente internamente o en el extremo N o C de la(s) isoforma(s) de proteína seleccionada(s). Para una edición óptima mediada por CRISPR, es crucial colocar los dos sgRNAs adecuadamente cerca del sitio de knock-in previsto....

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	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

Los resultados demuestran una estrategia simplificada y sencilla basada en CRISPR de un solo paso para etiquetar genes endógenos en Drosophila. En el protocolo, utilizamos dos ARNg para inducir la rotura de la doble cadena de ADN y la recombinación homóloga de manera más eficiente. Los ARNg y el plásmido donante se inyectan en embriones de mosca de la fruta, que expresan la enzima Cas9 en su línea germinal. Estos embriones se cultivan posteriormente en condiciones normales hasta la edad adulta, momento en ...

Las proteínas fluorescentes han surgido como herramientas poderosas para visualizar la localización de proteínas, la dinámica y las interacciones proteína-proteína en células dentro de organismos vivos 1,2. El marcaje de genes endógenos con proteínas fluorescentes permite obtener imágenes en vivo a largo plazo de los procesos celulares con resolución subcelular. Además, estas técnicas de marcaje de genes endógenos tienen varias ventajas en comparación con los enfoques de sobreexpresión e inmunotinción. Por ejemplo, la sobreexpresión de proteínas puede conducir a un mal plegamiento de proteínas, interacciones inespecíficas proteína-proteína y mala localización3. Hasta la fecha, los investigadores han sido capaces de crear vastas bibliotecas de genes endógenos fusionados con proteínas fluorescentes para unos pocos organismos modelo, como la levadura en ciernes, que puede someterse a unarecombinación homóloga eficiente. En el caso de Drosophila melanogaster, se han ideado varias herramientas como MiMICs5, trampas potenciadorasbasadas en transposones 6 y fosmids7 para marcar genes de forma fluorescente.
El desarrollo de herramientas basadas en CRISPR-Cas9 ha hecho posible realizar de manera eficiente la edición del genoma, incluido el etiquetado de proteínas endógenas, en una amplia gama de organismos modelo 8,9. Cas9 es una enzima guiada por ARN que escinde el ADN bicatenario de una manera altamente eficiente y específica8, que luego puede ser reparado por una vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ) que conduce a mutaciones puntuales o deleciones. Alternativamente, la vía de reparación dirigida por homología (HDR) permite la integración del ADN heterólogo en el cromosoma.
Los métodos anteriores para el etiquetado de genes basado en CRISPR en el organismo modelo, Drosophila melanogaster, se han basado en un proceso de dos pasos 10,11,12. Esto implica el uso de un marcador de color de ojos discernible, Dsred, para detectar eventos HDR exitosos. Posteriormente, el marcador Dsred se extirparía mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. Para agilizar y agilizar este proceso, aquí te presentamos un método más sencillo y eficiente. Este enfoque evita la necesidad de genotipado letal y permite la detección directa de moscas individuales. Específicamente, empleamos un enfoque basado en PCR para extraer ADN de un pequeño segmento de la pata media de la mosca, lo que nos permite genotipar moscas individuales. Cabe destacar que este procedimiento no compromete la vitalidad, el movimiento o las capacidades reproductivas de la mosca muestreada. Solo los individuos apropiados, identificados a través de este método, se convierten en poblaciones estables.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para generar moscas marcadas con proteínas fluorescentes en el que los genes endógenos se marcan con reporteros fluorescentes. Esta técnica utiliza la edición del genoma CRISPR-Cas9 para fusionar cualquier etiqueta de fluoróforo deseada con el terminal N o C de un gen endógeno. A continuación, describimos el diseño y la construcción de plásmidos de ARNg y un plásmido de donante, la estrategia de cribado de un solo paso para seleccionar moscas positivas para CRISPR y los pasos para establecer líneas estables. Específicamente, describimos estrategias para marcar un gen endógeno de Drosophila, punto, con un fluoróforo en el terminal C. También describimos brevemente los experimentos de control que deben realizarse para confirmar que la proteína marcada es funcional y las técnicas de imagen en vivo para visualizar la proteína Period en neuronas de reloj vivo dentro de cerebros intactos de Drosophila 13. El protocolo descrito aquí también es ampliamente aplicable a los candidatos para la deleción e inserción de fragmentos específicos de ADN mediante la edición del genoma CRISPR-Cas9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

El estudio de la localización, dinámica y regulación de proteínas subcelulares en células vivas se ha transformado profundamente con el advenimiento de técnicas que permiten el marcaje de genes endógenos para producir proteínas de fusión fluorescentes. Estos métodos permiten a los investigadores visualizar el comportamiento de las proteínas en tiempo real, proporcionando información valiosa sobre sus funciones e interacciones dentro del entorno celular. Muchos estudios actuales de etiquetado genético emplean un proceso de dos pasos en el que los marcadores visibles, como los cambios en el color de los ojos, se utilizan para identificar organismos modificados genéticamente en el primer paso, y el marcador visible se extirpa en el segundo paso. Aquí, presentamos un protocolo de un solo paso para realizar un etiquetado genético endógeno preciso y rápido en Drosophila melanogaster, que permite la detección de líneas diseñadas sin el marcador ocular visible, lo que ofrece una ventaja significativa sobre los métodos anteriores. Para detectar eventos exitosos de marcaje de genes, empleamos una técnica basada en PCR para genotipar moscas individuales mediante el análisis de un pequeño segmento de su pata media. Las moscas que superan los criterios de selección se utilizan para producir poblaciones estables. Aquí, detallamos el diseño y la construcción de plásmidos de edición CRISPR y los métodos para el cribado y la confirmación de líneas de ingeniería. En conjunto, este protocolo mejora significativamente la eficiencia del marcaje de genes endógenos en Drosophila y permite estudios de procesos celulares in vivo.

En nuestros experimentos, normalmente encontramos una tasa de éxito de ~20%-30% en la detección de varios genes endógenos marcados en todos los cromosomas (X, II, III). La eficiencia de este proceso puede variar en función de varios factores, como la selección del ARNg, la naturaleza del gen y la calidad de la inyección. Aquí, ilustramos los resultados de nuestra estrategia para marcar el gen del período endógeno con el fluoróforo mNeonGreen13. E...

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One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

El propósito de este protocolo es generar una línea de mosca editada endógena. Mostramos como ejemplo un knock-in de proteína fluorescente, pero también podría aplicarse a otros knock-in, knock-out, así como a la generación de mutaciones. Nuestro protocolo es un método basado en la recombinación homóloga de CRISPR, por lo que casi no hay restricciones en los sitios de mutación.Además, nuestro protocolo redujo en gran medida el tiempo y el esfuerzo involucrados en los pasos de genotipado. Para empezar, abra el sitio web de fly CRISPR para diseñar sgRNAs para Drosophila, e introduzca aproximadamente 100 secuencias de pares de bases que rodeen la ubicación deseada del knock-in. Seleccione objetivos CRISPR con la opción de guanina de cinco primos.Haga clic en el botón Buscar objetivos CRISPR para generar una lista de posibles secuencias de sgRNA. A continuación, haga clic en el botón de evaluación de cada secuencia y elija dos sgRNAs que tengan cero objetivos externos. Dado que los niveles de expresión natural de proteínas suelen ser mucho más bajos, seleccione etiquetas fluorescentes que sean brillantes y fotoestables, y que se ajusten a la configuración experimental.A continuación, diseñe un enlazador para vincular las etiquetas de epítopos al marcador fluorescente para el análisis bioquímico. Utilice un péptido enlazador que oscile entre dos y 20 aminoácidos, que comprenda aminoácidos como la glicina y la serina. Para diseñar el vector donante de Drosophila, organice la secuencia de ADN del péptido enlazador y la etiqueta fluorescente, y asegure secuencias homólogas que flanqueen ambos extremos.Modifique cualquier secuencia de PAM dentro del plásmido donante para mantener la secuencia de aminoácidos de las proteínas resultante. A continuación, coloque los codones de inicio y parada en función de la ubicación de la etiqueta. Para el marcaje interno, asegúrese de que la etiqueta fluorescente esté en el marco con la secuencia codificante del gen diana.Para el marcaje N-terminal, coloque la etiqueta fluorescente después del codón de inicio endógeno. Para el marcado C-terminal, coloque la etiqueta fluorescente antes del codón de parada natural. Asegúrese de conservar un solo codón de inicio para evitar posibles problemas de traducción.Utilice el enfoque alternativo de clonación basado en enzimas de restricción para insertar la secuencia de sgRNA en el plásmido U6 Bbs1-chiRNA. Después de crear el plásmido sgRNA, transforme el plásmido en DH5-Alpha Escherichia coli según las instrucciones del fabricante. Verifique los clones resultantes a través de la secuenciación Sanger, utilizando cebadores de secuenciación estándar T3 o T7.Para crear el plásmido donante, utilice ADN bicatenario con la secuencia deseada e intégrelo en el sitio de clonación múltiple negativo del plásmido Bluesript 2SK. Secuenciar el plásmido donante para asegurarse de que las secuencias de sgRNA o PAM se modifiquen correctamente y que no haya SNP presentes en el plásmido. A continuación, tome moscas Cas9 inyectadas con el ARNg construido y plásmidos donantes.Anestesiar las moscas con dióxido de carbono y separar las moscas macho de las hembras vírgenes. Para establecer cruces de moscas, empareje cada macho G zero con al menos dos hembras vírgenes FM7L en viales individuales estrechos de alimento CT. Coloque los viales cruzados en una incubadora ventilada mantenida a 25 grados centígrados y 60% de humedad hasta que las moscas F1 se cierren.A continuación, anestesia y recoge al menos 10 crías femeninas vírgenes de cruces de machos y hembras G zero. Asegúrese de que cada mosca F1 esté etiquetada con los detalles de su parentesco y almacenada por separado. Para detectar la PCR en las moscas, diseñe cebadores con una temperatura de fusión de alrededor de 55 grados centígrados que abarquen el sitio de edición del gen diana.Prepare un tampón de lisis para cada muestra de mosca y dispense 10 microlitros en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Mantenga el tampón a una temperatura fría durante el proceso de disección de la pierna. A continuación, prepare tubos capilares de vidrio, llenando un extremo con comida de agar sacarosa.Coloque estos tubos en una placa de pocillos de 96 pocillos de profundidad, conocida como el hotel de moscas. Para la disección de las piernas, coloque la almohadilla de anestesia de dióxido de carbono bajo un microscopio estereoscópico. Anestesiar una mosca candidata y cortarle una de sus patas medias.Después de eso, sumerja la pierna en el tampón de lisis. Sostén el ala de la mosca con un par de pinzas de metal fino. Mueva la mosca al hotel de mosca y selle el tubo con hilo inmediatamente.Aloje el hotel de moscas en una incubadora ventilada mantenida a 25 grados centígrados y 60% de humedad. Sumerja las patas cortadas en la solución tampón de lisis en un termociclador. Organice la reacción de PCR según las instrucciones del fabricante, utilizando 1,5 microlitros del lisado de patas de mosca como fuente de ADN.Someter los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa e interpretar los resultados en función del tamaño de la banda. En función de los resultados del gel, seleccione las moscas positivas del hotel de moscas y crúcelas individualmente con moscas de equilibrio para producir la generación F2. Utilice material homocigótico para la secuenciación Sanger del sitio de edición para garantizar la precisión.Cruza las líneas de mosca validadas con moscas de tipo salvaje para eliminar las mutaciones de fondo. Realice pruebas de detección en cada generación mediante el protocolo de PCR de una sola pierna. Las imágenes de microscopio confocal de cerebros adultos de Drosophila mostraron proteínas del período organizadas en focos nucleares discretos a lo largo de la noche y las primeras horas de la mañana.En general, este protocolo es sólido si sus cebadores de PCR de genotipado son específicos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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Investigación

Neurociencias

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determinación de la actividad locomotora espontánea en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Ensayo sencillo para cuantificación de Prevención Social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Condiciones que afectan Espacio Social en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

De alta resolución de cuantificación del comportamiento guiado Olor en<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uso de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

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Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

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Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

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