Name: one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Protokol geliştirmenin ilk aşamalarındaki tartışmalar için George Watase ve Josie Clowney'e teşekkür ederiz. Çalışma, NIH (S.Y.'ye hibe no. R35GM133737), Alfred P. Sloan Bursu (S.Y.'ye) ve McKnight Scholar Ödülü'nden (S.Y.'ye) sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

1. Gen düzenleme reaktiflerinin tasarımı ve yapımı
NOT: Endojen etiketleme yapmak için, istenen genin çeşitli izoformlarını tanımlamak esastır. Deneyin özel hedeflerine bağlı olarak, bir floresan etiketi dahili olarak veya seçilen protein izoformlarının N- veya C-terminallerine dahil edilebilir. Optimum CRISPR aracılı düzenleme için, iki sgRNA'yı amaçlanan knock-in bölgesine uygun şekilde yakın konumlandırmak çok önemlidir. Daha sonra, homolog rekombinasyon yoluyla ...

<ol>
	<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li><li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments.">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nat Commun. 6, 7670 (2015).</li><li>Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transience+of+transient+overexpression.">The transience of transient overexpression.</a> Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Quinones-Coello, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+strategies+for+protein+trapping+in+Drosophila.">Exploring strategies for protein trapping in Drosophila.</a> Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> Elife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+CRISPR-based+strategy+to+insert+small+and+large+fragments+of+DNA+using+short+homology+arms.">An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms.</a> Elife. 8, e51539 (2019).</li><li>Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+strategies+for+scarless+allele+replacement+in+Drosophila+using+CRISPR/Cas9.">Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9.</a> Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).</li><li>Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clock+proteins+regulate+spatiotemporal+organization+of+clock+genes+to+control+circadian+rhythms.">Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li><li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins:+a+cell+biologist's+user+guide.">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li><li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination.">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077 (2022).</li><li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit.">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li><li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila.">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li><li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region.">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li></ol>

Sonuçlar, Drosophila'daki endojen genleri etiketlemek için aerodinamik, basit, tek adımlı CRISPR tabanlı bir stratejiyi göstermektedir. Protokolde, DNA çift sarmallı kırılmayı ve homolog rekombinasyonu daha verimli bir şekilde indüklemek için iki gRNA kullanıyoruz. gRNA'lar ve donör plazmid, germ hatlarında Cas9 enzimini eksprese eden meyve sineği embriyolarına enjekte edilir. Bu embriyolar daha sonra yetişkinliğe kadar standart koşullar altında yetiştirilir ve bu noktada birinci nesil (F...

Floresan proteinler, canlı organizmalardaki hücrelerde protein lokalizasyonunu, dinamiklerini ve protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için güçlü araçlar olarak ortaya çıkmıştır 1,2. Endojen genlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, hücresel süreçlerin hücre altı çözünürlükle uzun süreli canlı görüntülenmesini sağlar. Ayrıca, bu endojen gen etiketleme teknikleri, aşırı ekspresyon ve immün boyama yaklaşımlarına kıyasla çeşitli avantajlara sahiptir. Örneğin, proteinlerin aşırı ekspresyonu, proteinin yanlış katlanmasına, spesifik olmayan protein-protein etkileşimlerine ve yanlış lokalizasyonayol açabilir 3. Bugüne kadar, araştırmacılar, verimli homolog rekombinasyona maruz kalabilen tomurcuklanan maya gibi birkaç model organizma için floresan proteinlere kaynaşmış endojen genlerin geniş kütüphanelerini oluşturabildiler4. Drosophila melanogaster durumunda, genleri floresan olarak etiketlemek için MiMICs5, transpozon tabanlı arttırıcı tuzaklar6 ve fosmidler7 gibi çeşitli araçlar tasarlanmıştır.
CRISPR-Cas9 tabanlı araçların geliştirilmesi, çok çeşitli model organizmalardaendojen proteinlerin etiketlenmesi de dahil olmak üzere genom düzenlemesini verimli bir şekilde gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır 8,9. Cas9, çift sarmallı DNA'yı oldukça verimli ve spesifik bir şekilde parçalayanRNA kılavuzlu bir enzimdir 8, daha sonra nokta mutasyonlarına veya delesyonlara yol açan homolog olmayan bir uç birleştirme (NHEJ) yolu ile onarılabilir. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) yolu, heterolog DNA'nın kromozoma entegrasyonuna izin verir.
Model organizma Drosophila melanogaster'de CRISPR tabanlı gen etiketleme için geçmiş yöntemler, iki aşamalı bir sürecedayanmaktadır 10,11,12. Bu, başarılı HDR olaylarını tespit etmek için fark edilebilir bir göz rengi işaretleyicisi olan Dsred'in kullanılmasını içerir. Daha sonra, Dsred markörü Cre / loxP rekombinasyon sistemi kullanılarak eksize edilecektir. Bu süreci kolaylaştırmak ve hızlandırmak için burada daha basit ve daha verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, ölümcül genotipleme ihtiyacını ortadan kaldırır ve bireysel sineklerin doğrudan taranmasına izin verir. Spesifik olarak, sineğin orta bacağının küçük bir bölümünden DNA çıkarmak için PCR tabanlı bir yaklaşım kullanıyoruz ve bu da tek tek sinekleri genotiplememize izin veriyor. Özellikle, bu prosedür, örneklenen sineğin canlılığını, hareketini veya üreme yeteneklerini tehlikeye atmaz. Yalnızca bu yöntemle belirlenen uygun kişiler, istikrarlı hisse senetlerine dönüştürülür.
Burada, endojen genlerin floresan raportörlerle etiketlendiği floresan protein etiketli sinekler üretmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, istenen herhangi bir florofor etiketini endojen bir genin N- veya C- terminaline kaynaştırmak için CRISPR-Cas9 genom düzenlemesini kullanır. Aşağıda, gRNA plazmitlerinin ve bir donör plazmidinin tasarımını ve yapımını, CRISPR pozitif sinekleri seçmek için tek adımlı tarama stratejisini ve kararlı çizgiler oluşturma adımlarını açıklıyoruz. Spesifik olarak, endojen bir çekirdek saat Drosophila genini, dönemi, C-terminalinde bir florofor ile etiketleme stratejilerini açıklıyoruz. Ayrıca, etiketli proteinin işlevsel olduğunu doğrulamak için yapılması gereken kontrol deneylerini ve bozulmamış Drosophila beyinleri13 içindeki canlı saat nöronlarında Periyot proteinini görselleştirmek için canlı görüntüleme tekniklerini kısaca açıklıyoruz. Burada açıklanan protokol, CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi ile belirli DNA bitlerinin silinmesi ve eklenmesi için tarama adaylarına da geniş ölçüde uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA pH8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-alpha Competent&#160;E. coli&#160;(High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well deep well plate</td>
			<td>BRAND</td>
			<td>701354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3539S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Glass Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Drosophila Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21720001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XbaI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step crispr-based strategy for endogenous gene tagging in drosophila melanogaster

Canlı hücrelerde protein hücre altı lokalizasyonu, dinamikleri ve regülasyonu üzerine yapılan çalışmalar, floresan füzyon proteinleri üretmek için endojen genlerin etiketlenmesine izin veren tekniklerin ortaya çıkmasıyla derinden dönüştürülmüştür. Bu yöntemler, araştırmacıların protein davranışını gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerini sağlayarak, hücresel ortamdaki işlevleri ve etkileşimleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Mevcut birçok gen etiketleme çalışması, ilk adımda genetiği değiştirilmiş organizmaları tanımlamak için göz rengi değişiklikleri gibi görünür belirteçlerin kullanıldığı ve ikinci adımda görünür işaretleyicinin eksize edildiği iki aşamalı bir süreç kullanır. Burada, Drosophila melanogaster'de hassas ve hızlı endojen gen etiketlemesi gerçekleştirmek için tek adımlı bir protokol sunuyoruz, bu da görünür göz işaretleyicisi olmadan tasarlanmış hatların taranmasını sağlar ve geçmiş yöntemlere göre önemli bir avantaj sunar. Başarılı gen etiketleme olaylarını taramak için, orta bacaklarından küçük bir segmenti analiz ederek tek tek sinekleri genotiplemek için PCR tabanlı bir teknik kullanıyoruz. Tarama kriterlerini geçen sinekler daha sonra istikrarlı stoklar üretmek için kullanılır. Burada, CRISPR düzenleme plazmitlerinin tasarımını ve yapımını ve mühendislik hatlarının taranması ve doğrulanması için yöntemleri detaylandırıyoruz. Birlikte, bu protokol Drosophila'da endojen gen etiketlemesinin etkinliğini önemli ölçüde artırır ve in vivo hücresel süreçlerin incelenmesini sağlar.

Deneylerimizde, tipik olarak, tüm kromozomlarda (X, II, III) çeşitli endojen etiketli genlerin taranmasında ~% 20 -% 30'luk bir başarı oranı bulduk. Bu işlemin verimliliği, gRNA seçimi, genin doğası ve enjeksiyon kalitesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak değişebilir. Burada, endojen dönem genini mNeonGreen florofor13 ile etiketleme stratejimizin sonuçlarını gösteriyoruz. D. melanogaster'in X kromozomu üzerinde yer alan...

Watch this Scientific Journal Video about One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster at JoVE.com

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Burada, başarılı genetik modifikasyonların işaretsiz tanımlanması için PCR tabanlı bir teknik kullanan ve stabil knock-in hatlarının geliştirilmesini kolaylaştıran Drosophila için basitleştirilmiş bir endojen gen etiketleme protokolü sunuyoruz.

Drosophila melanogaster'de Endojen Gen Etiketleme için Tek Adımlı CRISPR Tabanlı Strateji

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

Bu protokolün amacı, endojen düzenlenmiş bir sinek hattı oluşturmaktır. Örnek olarak bir floresan protein knock-in'i gösteriyoruz, ancak diğer knock-in, knockout ve mutasyon oluşumuna da uygulanabilir. Protokolümüz CRISPR homolog rekombinasyon tabanlı bir yöntemdir, bu nedenle mutasyon bölgelerinde neredeyse hiçbir kısıtlama yoktur.Ayrıca, protokolümüz genotipleme adımlarında harcanan zamanı ve çabayı büyük ölçüde azalttı. Başlamak için, Drosophila için sgRNA'lar tasarlamak üzere fly CRISPR web sitesini açın ve istenen knock-in konumunu çevreleyen yaklaşık 100 baz çifti dizisi girin. Beş ana guanin seçeneğiyle CRISPR hedeflerini seçin.Olası sgRNA dizilerinin bir listesini oluşturmak için CRISPR hedeflerini bul düğmesine tıklayın. Ardından her dizi için değerlendir düğmesine tıklayın ve sıfır hedefi olan iki sgRNA seçin. Doğal protein ekspresyon seviyeleri tipik olarak çok daha düşük olduğundan, parlak ve fotostabil olan ve deney düzeneğine uyan floresan etiketleri seçin.Ardından, epitop etiketlerini biyokimyasal analiz için floresan işaretleyiciye bağlamak için bir bağlayıcı tasarlayın. Glisin ve serin gibi amino asitleri içeren iki ila 20 amino asit arasında değişen bir bağlayıcı peptit kullanın. Drosophila için donör vektörünü tasarlamak için, bağlayıcı peptitin ve floresan etiketin DNA dizisini düzenleyin ve her iki ucu çevreleyen homolog diziler sağlayın.Elde edilen protein amino asit dizisini korumak için donör plazmidi içindeki herhangi bir PAM dizisini değiştirin. Ardından, etiket konumuna bağlı olarak başlatma ve durdurma kodonlarını konumlandırın. Dahili etiketleme için, floresan etiketin hedef genin kodlama dizisiyle çerçevede olduğundan emin olun.N-terminal etiketleme için, floresan etiketini endojen başlangıç kodonundan sonra konumlandırın. C-terminali etiketlemesi için, floresan etiketini doğal durdurma kodonunun önüne yerleştirin. Olası çeviri sorunlarını önlemek için yalnızca tek bir başlangıç kodonunu sakladığınızdan emin olun.sgRNA dizisini plazmid U6 Bbs1-chiRNA plazmidine eklemek için alternatif restriksiyon enzimi tabanlı klonlama yaklaşımını kullanın. SgRNA plazmidini oluşturduktan sonra, plazmiti üreticinin talimatlarına göre DH5-Alfa Escherichia coli'ye dönüştürün. Elde edilen klonları, T3 veya T7 standart dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilimi yoluyla doğrulayın.Donör plazmidini oluşturmak için, istenen diziye sahip çift sarmallı DNA kullanın ve onu plazmid Bluesript 2SK negatif çoklu klonlama bölgesine entegre edin. sgRNA veya PAM dizilerinin doğru şekilde değiştirildiğinden ve plazmidde SNP bulunmadığından emin olmak için donör plazmitini sıralayın. Ardından, yapılandırılmış gRNA ve donör plazmitleri ile enjekte edilen Cas9 sineklerini alın.Sinekleri karbondioksit ile uyuşturun ve erkek sinekleri ve bakire dişileri ayırın. Sinek çaprazları oluşturmak için, her bir G sıfır erkeği ayrı dar CT gıda şişelerinde en az iki FM7L bakire dişi ile eşleştirin. Çapraz şişeleri, F1 yaklaşana kadar 25 santigrat derece ve% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatöre yerleştirin.Daha sonra anestezi uygulayın ve hem G sıfır erkek hem de dişi melezlerden en az 10 bakire dişi yavru toplayın. Her F1 sineğinin ebeveyninin ayrıntılarıyla etiketlendiğinden ve ayrı olarak saklandığından emin olun. Sinekleri PCR için taramak için, hedef genin düzenleme bölgesini kapsayan yaklaşık 55 santigrat derece erime sıcaklığına sahip primerler tasarlayın.Her sinek numunesi için lizis tamponu hazırlayın ve 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre dağıtın. Bacak diseksiyon işlemi sırasında tamponu soğuk bir sıcaklıkta tutun. Daha sonra, bir ucunu sakaroz agar yemi ile doldurarak cam kılcal tüpler hazırlayın.Bu tüpleri, sinek oteli olarak adlandırılan 96 kuyu derinliğinde bir kuyu plakasına yerleştirin. Bacak diseksiyonu için, karbondioksit anestezi pedini stereo mikroskop altında konumlandırın. Aday bir sineği uyuşturun ve orta bacaklarından birini kesin.Bundan sonra, bacağı lizis tamponuna daldırın. Sinek kanadını bir çift ince metal forseps ile tutun. Sineği sinek oteline taşıyın ve tüpü hemen iplikle kapatın.Sinek otelini 25 santigrat derece ve% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatörde barındırın. Kopan bacakları bir termal döngüleyicide lizis tampon çözeltisine daldırın. DNA kaynağı olarak 1.5 mikrolitre sinek bacağı lizatı kullanarak PCR reaksiyonunu üretici tarafından talimat verildiği şekilde düzenleyin.PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezine tabi tutun ve sonuçları bant boyutuna göre yorumlayın. Jel sonuçlarına dayanarak, uçuş otelinden pozitif sinekleri seçin ve F2 neslini üretmek için bunları dengeleyici sineklerle ayrı ayrı çaprazlayın. Doğruluğu sağlamak için düzenleme sitesinin Sanger sıralaması için homozigot stokları kullanın.Arka plan mutasyonlarını ortadan kaldırmak için vahşi tip sineklerle geri çapraz doğrulanmış sinek çizgileri. Tek bacaklı PCR protokolünü kullanarak her nesli tarayın. Yetişkin Drosophila beyinlerinin konfokal mikroskop görüntüleri, gece geç saatlerde ve sabahın erken saatlerinde gizli nükleer odaklar halinde organize edilmiş dönem proteini gösterdi.Genel olarak, genotipleme PCR primerleriniz spesifikse bu protokol sağlamdır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Sosyal Kaçınma Niceleme için Basit Testi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Sosyal Space Etkileyen Koşullar<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Drosophila melanogaster</emKullanma&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...