Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Forfatterne anerkender Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef og Milan Intezar for deres ekspertise og tekniske bistand. Finansieringskilder: Merck Serono (A16-1395), Goodlife og Ferring.

TurnerFertility-undersøgelsesprotokollen er godkendt af Central Committee on Research Involving Human Subjects (NL57738.000.16). I denne undersøgelse blev ovariebarkvævet hos 93 kvinder med TS opnået. Materialer, der kræver sikkerhedsforanstaltninger, er angivet i tabel 1.
Tabel 1: Sikkerhedsforanstaltninger.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Materiale</td>
			<td ...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

FISH-analyse er en velkendt teknik til påvisning af X-kromosomafvigelser i lymfocytter eller bukkalceller hos både mænd og kvinder10. Flere undersøgelser har beskrevet FISH på kønsceller hos mænd med X-kromosomafvigelser, men detaljerede oplysninger opnået af FISH om ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser mangler stadig14. Denne artikel præsenterer nye metoder baseret på FISH til at bestemme, om aneuploidier er til stede i ovariecellerne i ikke-podet og...

Infertilitet er et sundhedsproblem i det mandlige eller kvindelige reproduktive system, der påvirker ca. 186 millioner individer i reproduktiv alderverden over 1. I mindst 35% af infertile par er infertilitet forårsaget af en lidelse i det kvindelige reproduktive system2. Der er mange faktorer, der kan forårsage kvindelig infertilitet, såsom genetiske faktorer, genitale abnormiteter, endokrin dysfunktion, inflammatoriske sygdomme og iatrogen behandling3.
Genetiske abnormiteter er til stede hos ca. 10% af infertile kvinder 4,5. Af alle genetiske abnormiteter er X-kromosomafvigelser den mest almindelige årsag til ovariedysgenese2. Flere undersøgelser har rapporteret, at X-kromosomafvigelser hos kvinder med Turners syndrom (TS) eller Triple X syndrom er forbundet med for tidlig ovariesvigt på grund af et accelereret tab af kimceller eller nedsat oogenese 6,7,8.
Aberrationer af X-kromosomet kan opdeles i: 1) numeriske aberrationer, hvor antallet af X-kromosomer er anderledes, men X-kromosomerne er intakte; og 2) strukturelle aberrationer, hvor X-kromosomet har fået eller mistet genetisk materiale 3,9. Numeriske aberrationer af X-kromosomet er mere almindelige end strukturelle abnormiteter og skyldes ofte spontane fejl under celledeling 3,9. Når en sådan fejl opstår under meiose, kan det føre til aneuploide gameter og i sidste ende til afkom med kromosomafvigelser i alle celler. Når kromosomdefekter opstår i somatiske celler som følge af fejl, der opstår under mitose i de tidlige stadier af ontogenese, kan det føre til mosaikisme. I disse individer er både celler med normalt X-kromosomindhold og celler med X-kromosomafvigelser til stede.
I 1980'erne blev en cytogenetisk teknik kaldet fluorescens in situ hybridisering (FISH) udviklet til at visualisere og lokalisere specifikke nukleinsyresekvenser på metafase og interfasekromosomer10,11. Denne teknik bruger fluorescerende mærkede DNA-sonder til at binde til en bestemt sekvens i kromosomet, som derefter kan visualiseres ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
I dag anvendes FISH i vid udstrækning som et klinisk diagnostisk værktøj og betragtes som guldstandarden til påvisning af kromosomafvigelser10. Inden for reproduktiv medicin er FISH-analyse på sædceller blevet brugt til at få indsigt i X-kromosomindholdet i spermatozoer hos mænd med numeriske eller strukturelle kromosomafvigelser i somatiske celler12,13,14. Disse undersøgelser viste, at mænd med kromosomafvigelser var mere tilbøjelige til at have en højere frekvens af aneuploide spermatozoer til stede i deres sæd sammenlignet med mænd med normale karyotyper12,13,14.
I modsætning til spermatozoer er meget lidt kendt om X-kromosomindholdet i ovarieceller (herunder oocytter, granulosa / theca-celler og stromale celler) hos personer med kromosomafvigelse samt de mulige konsekvenser af aneuploidier af disse celler på deres reproduktive potentiale. En vigtig årsag til den knappe information om karyotypen af ovarieceller sammenlignet med spermatozoer er, at kvinder skal gennemgå en invasiv procedure såsom en follikelpunktur eller operation for at opnå oocytter eller ovariebarkvæv. Kvindelige kønsceller er derfor vanskelige at skaffe til forskningsformål.
I øjeblikket udføres et observationsinterventionsstudie i Holland for at undersøge effekten af kryopræservering af ovarievæv hos unge kvinder med TS15. Et fragment af patientens ovariebarkvæv var tilgængeligt for at identificere X-kromosomindholdet i ovariecellerne16,17. Som en del af undersøgelsen blev der udviklet en ny metode baseret på FISH af dissocieret ovariebarkvæv for at bestemme, om kromosomafvigelser er til stede i ovarieceller hos kvinder, der bærer en kromosomafvigelse i ikke-ovariesomatiske celler, såsom lymfocytter eller bukkalceller. Derudover blev virkningen af aneuploidier i ovarieceller på follikulogenese også bestemt. Til dette formål blev en etableret FISH-protokol modificeret, der muliggør analyse af histologiske sektioner af ovariebarkvæv efter kunstigt induceret follikulogenese under langvarig xenotransplantation hos immunkompromitterede mus. I denne undersøgelse præsenterer vi to metoder baseret på FISH til at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller i ikke-podet og podet ovariebarkvæv hos kvinder med X-kromosomafvigelser med det formål at forbedre grundvidenskaben om dette emne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Millioner af mennesker verden over beskæftiger sig med spørgsmål vedrørende fertilitet. Nedsat fertilitet eller endda infertilitet kan skyldes mange forskellige årsager, herunder genetiske lidelser, hvoraf kromosomale abnormiteter er de mest almindelige. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en velkendt og hyppigt anvendt metode til at detektere kromosomafvigelser hos mennesker. FISH anvendes hovedsageligt til analyse af kromosomale abnormiteter i spermatozoer hos mænd med numeriske eller strukturelle kromosomale aberrationer. Desuden anvendes denne teknik også ofte hos kvinder til at detektere X-kromosomafvigelser, der vides at forårsage ovariedysgenese. Der mangler dog stadig oplysninger om X-kromosomindholdet i ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser i lymfocytter og/eller bukkalceller.
Formålet med denne undersøgelse er at fremme grundforskning vedrørende X-kromosomafvigelser hos kvinder ved at præsentere to metoder baseret på FISH til at identificere X-kromosomindholdet i ovarieceller. For det første beskrives en metode til bestemmelse af X-kromosomindholdet i isolerede ovarieceller (oocytter, granulosaceller og stromale celler) i ikke-podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser. Den anden metode er rettet mod at evaluere virkningen af kromosomafvigelser på follikulogenese ved at bestemme X-kromosomindholdet i ovarieceller i nydannede sekundære og antrale follikler i ovarievæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser efter langvarig podning i immunkompromitterede mus. Begge metoder kan være nyttige i fremtidig forskning for at få indsigt i reproduktionspotentialet hos kvinder med X-kromosomafvigelser.

FISH på isolerede ovarieceller før podning Kryopræserveret ovariebarkvæv fra kvinder med 45,X/46,XX (patient A) eller 45,X/46,XX/47,XXX (patient B) TS blev anvendt til at illustrere resultaterne ved hjælp af denne protokol. Hos patient A havde 50 % af lymfocytterne en karyotype på 45,X og 50 % havde 46,XX. Hos patient B var 38 % af lymfocytterne 45,X, 28 % 46,XX og 34 % 47,XXX. Centromerspecifikke sonder til kromosom X (grøn) og kromosom 18 som kontrol (rød) blev brugt til at bestemme X-kromos...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Denne artikel præsenterer to metoder baseret på fluorescens in situ hybridisering til bestemmelse af X-kromosomindholdet i ovarieceller i ikke-podet og podet ovariebarkvæv fra kvinder med X-kromosomafvigelser.

Udforskning af X-kromosomafvigelser i ovarieceller ved hjælp af fluorescens in situ-hybridisering

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

FISH-analyse af ovarieceller fra kvinder med X-kromosomafvigelser er en unik teknik til at få indsigt i X-kromosomindholdet i ovarieceller i denne specifikke gruppe. Disse teknikker kan være nyttige til at lære mere om reproduktionspotentiale hos kvinder med X-kromosomafvigelser. Det er vigtigt at nævne, at begge metoder er beregnet til at lette fremtidig forskning og ikke er designet til at blive brugt som et diagnostisk værktøj i klinisk praksis.Ronald Peek, seniorforsker fra vores fertilitetslaboratorium, og Milad Intezar, analytiker fra vores patologiafdeling, vil demonstrere proceduren. Til at begynde med skal du skære det kryopræserverede eller optøede ovariebarkvæv i små stykker på en efter en millimeter ved hjælp af en skalpel. Enzymatisk fordøje vævsfragmenterne i fire liter forvarmet L15 i 75 minutter ved 37 grader Celsius.Pipette fordøjelsesblandingen op og ned hvert 15. minut. Stop den enzymatiske fordøjelse ved at tilføje fire milliliter kold L15 suppleret med 10% føtalt bovin serum eller FBS. Det dissocierede væv vaskes en gang med otte ml koldt L15-medium ved centrifugering ved 500 g, før det opslæmmes igen i 500 mikroliter L15-medium.Cellesuspensionen, der hovedsageligt indeholder individuelle stromale celler og små follikler, overføres til en petriskål af plast, og suspensionen undersøges under et stereomikroskop. Vælg folliklerne mindre end 50 mikrometer i størrelse manuelt ved hjælp af en 75 mikrometer plastpipette, og overfør dem til dråben L15-medium suppleret med 10% FBS ved fire grader Celsius. Overfør derefter de rensede follikler til en opløsning af 0,06% trypsin, et milligram pr. milliliter EDTA og et milligram pr. milliliter glucose og inkuber i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Efter inkubation opnås ovariestromale celler fra cortexcellesuspensionen ved anvendelse af en 75 mikrometer plastpipette. Til fluorescens in situ-hybridisering eller FISH-analyse af individuelle ovarieceller overføres de behandlede ovariefollikler med trypsin / EDTA / glucose eller stromale celler til dråber på fem mikroliter 0,15 millimolært kaliumchlorid og 15 mikroliter DPBS på et dias og inkuberes i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Tør og præfikser diaset i 300 mikroliter 0,05 millimolært kaliumchlorid, 7,5% eddikesyre og 22,5% methanol i to minutter.Dæk diaset med tre-til-en methanoleddikesyre i to minutter for at afslutte fikseringen. Efter fiksering vaskes prøven to gange i frisklavet SSC ved 73 grader Celsius. Dæk det med 100 mikroliter 2%Proteinase K og forsegl det med en dæksel.Inkuber diaset i 10 minutter ved 37 grader Celsius i hybridiseringsstationen. Efter inkubation skal du fjerne dækselsedlen og vaske diaset i fem minutter i DPBS ved stuetemperatur under omrystning. Fastgør prøven i fem minutter med 1% formaldehyd.Derefter vaskes objektglasset i DPBS, og dehydreres serielt ved at øge ethanolkoncentrationerne i to minutter hver. Lufttør prøven, før den hybridiseres med fluorescerende mærkede sonder. Derefter tilsættes en mikroliter CEPX, en mikroliter CEP18 og 18 mikroliter hybridiseringsbuffer til prøven og forsegles med en dæksel, der limes på diaset.Overfør diaset til hybridiseringsstationen til denaturering ved 73 grader Celsius i tre minutter efterfulgt af hybridisering under en inkubation natten over ved 37 grader Celsius. Efter hybridisering skal du fjerne dækselsedlen og eventuel resterende lim fra diaset. Vask objektglasset i 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 ved 72 grader Celsius i to minutter, efterfulgt af inkubation i et minut i 2X SSC og 0,1% Tween-20.Dehydrer objektglasset som vist, og lufttør det i mørke, før du dækker det med et monteringsmedium, der indeholder DAPI. Placer objektglasset ved minus 20 grader Celsius i 10 minutter før analyse ved fluorescensmikroskopi. For at hybridisere paraffinsektioner skal du vælge nye sektioner før eller efter den sektion, der indeholder follikler fra paraffinbåndet.Monter en sektion på et glasglas, og tør det i 45 minutter på en komfur ved 56 grader Celsius. Afparaffiniser sektionen i xylen i 10 minutter, nedsænk derefter diaset i 99,5% ethanol, og skyl det i fem minutter i ledningsvand. Forbehandl objektglasset med målhentningsopløsningen i 10 minutter ved 96 grader Celsius.Efter afkøling skylles diaset i destilleret vand. Behandl diaset i fem minutter med 0,01 molær saltsyre efterfulgt af pepsinfordøjelse i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Objektglasset skylles igen i saltsyre og derefter i PBS.Fastgør diaset i 1% formaldehyd PBS i fem minutter. Skyl derefter forsigtigt objektglasset i PBS og igen i demineraliseret vand, før det dehydreres i 99,5% ethanol. Påfør fem mikroliter sonde CEP18 og CEPX på det forbehandlede dias.Påfør derefter en dækselseddel og forsegl området med fotolim. Placer diaset i en hybridisator til denaturering ved 80 grader Celsius i 10 minutter og hybridisering natten over ved 37 grader Celsius. Den næste dag skylles diaset to gange i fem minutter hver i SSC ved 42 grader Celsius, efterfulgt af en to minutter og et minuts skylning i 0,3% Nonidet P-40 ved 73 grader Celsius.Skyl igen objektglasset i 2X SSC efterfulgt af skylning i destilleret vand, før det dehydreres med 99,5% ethanol. Lufttør glideren, og monter den i DAPI-holdigt monteringsmedium. Kryopræserveret ovariebarkvæv hos patient A viste 50% af lymfocytterne, havde en 45, X karyotype og 50% havde 46, XX.In patient B var 38% af lymfocytterne 45, X, 28% var 46, XX og 34% var 47, XXX.Omgivende stromale celler blev også analyseret for X-kromosomindhold. Enzymatisk fordøjelse af ovariebarkvæv resulterede i en suspension af stort set dissocierede celler, men efterlod de oprindelige follikler, der består af en intakt oocyt omgivet af et enkelt lag granuloseceller. Små follikler gav vanskeligheder med at fortolke signaler efter FISH på grund af klumpningen af granulosecellerne.Yderligere fordøjelse af folliklerne med trypsin før FISH resulterede i, at individuelle granuloseceller trak sig sammen til en sfærisk morfologi på overfladen af folliklerne. Hæmatoxylin eosin farvning viste morfologisk normale sekundære og antrale follikler i ovariebarkvæv efter fem måneders xenografting. X-kromosomindholdet i granuloseceller i disse follikler blev bestemt ved FISH-analyse.Fiksering af podet ovariebarkvæv i Bouin-opløsning resulterede i slørede og stort set skjulte fluorescerende signaler i follikulære celler på grund af en grøn dis. I modsætning hertil gav ovariebarkvæv fastgjort i formaldehyd fremragende fluorescerende signaler. Den største udfordring ved denne protokol ligger i isoleringen af ovarieceller og den enzymatiske fordøjelse af vævet.Afvigelse fra denne protokol kan forårsage et betydeligt tab af ovarieceller under processen, og dette bør især undgås hos kvinder, der allerede har en lav ovariereserve. Yderligere genekspressionsprofilering kan være nyttigt for at lære mere om virkningen af aneuploide ovarieceller på follikulogenese og dermed processen med for tidlig ovariesvigt hos kvinder med X-kromosomafvigelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Mærkning af mitokondrie-DNA Replication i Drosophila Adult Ovarier af Edu Farvning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Tilfældig mutagenese ved anvendelse histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse af partikler i luften-induceret kromosomafvigelser Brug af en<em&gt; In vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning af Inter-kromosomale Stabil Afvigelser fra Multiple Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (MFISH) og Spectral Karyotyping (SKY) i bestrålede mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse af Optimal kromosomale placering for en DNA Element i Escherichia coli ved hjælp af en roman Transposon-medieret tilgang

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering af mikrobiota i kryds tarme af hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enkelt molekyle fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyser i spirende gær vegetativ vækst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Væv-specifikke miRNA udtryk profilering i mus hjerte sektioner ved hjælp af In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...