Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
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Les auteurs remercient Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef et Milan Intezar pour leur expertise et leur assistance technique. Sources de financement : Merck Serono (A16-1395), Goodlife et Ferring.

Le protocole de l’étude TurnerFertility a été approuvé par le Comité central de recherche sur des sujets humains (NL57738.000.16). Dans cette étude, le tissu du cortex ovarien de 93 femmes atteintes de SGT a été obtenu. Les matériaux qui nécessitent des précautions de sécurité sont énumérés dans le tableau 1.
Tableau 1 : Précautions de sécurité.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

L’analyse FISH est une technique bien connue pour détecter les aberrations chromosomiques X dans les lymphocytes ou les cellules buccales des mâles et des femelles10. Plusieurs études ont décrit FISH sur des gamètes de mâles présentant des aberrations chromosomiques X, mais les informations détaillées obtenues par FISH sur les cellules ovariennes de femelles présentant des aberrations chromosomiques X font encore défaut14. Cet article présente de nouvelles mé...

L’infertilité est un problème de santé du système reproducteur masculin ou féminin, affectant environ 186 millions de personnes en âge de procréer dans le monde1. Chez au moins 35% des couples infertiles, l’infertilité est causée par un trouble du système reproducteur féminin2. De nombreux facteurs peuvent causer l’infertilité féminine, tels que des facteurs génétiques, des anomalies des voies génitales, un dysfonctionnement endocrinien, des maladies inflammatoireset un traitement iatrogène3.
Des anomalies génétiques sont présentes chez environ 10 % des femelles infertiles 4,5. De toutes les anomalies génétiques, les aberrations du chromosome X sont la cause la plus fréquente de dysgénésie ovarienne2. Plusieurs études ont rapporté que les aberrations chromosomiques X chez les femmes atteintes du syndrome de Turner (TS) ou du syndrome Triple X sont associées à une insuffisance ovarienne prématurée due à une perte accélérée de cellules germinales ou à une altération de l’oogenèse 6,7,8.
Les aberrations du chromosome X peuvent être divisées en: 1) aberrations numériques, dans lesquelles le nombre de chromosomes X est différent mais les chromosomes X sont intacts; et 2) les aberrations structurelles, dans lesquelles le chromosome X a gagné ou perdu du matériel génétique 3,9. Les aberrations numériques du chromosome X sont plus fréquentes que les anomalies structurelles et sont souvent causées par des erreurs spontanées lors de la division cellulaire 3,9. Lorsqu’une telle erreur se produit pendant la méiose, elle peut conduire à des gamètes aneuploïdes et finalement à une progéniture avec des aberrations chromosomiques dans toutes les cellules. Lorsque des défauts chromosomiques apparaissent dans les cellules somatiques à la suite d’erreurs survenant pendant la mitose dans les premiers stades de l’ontogenèse, cela peut conduire au mosaïcisme. Chez ces individus, les cellules ayant un contenu chromosomique X normal et les cellules présentant des aberrations chromosomiques X sont présentes.
Dans les années 1980, une technique cytogénétique appelée hybridation in situ par fluorescence (FISH) a été développée pour visualiser et localiser des séquences d’acides nucléiques spécifiques sur les chromosomes métaphasiques et interphasiques10,11. Cette technique utilise des sondes d’ADN marquées par fluorescence pour se lier à une séquence spécifique du chromosome, qui peut ensuite être visualisée à l’aide d’un microscope à fluorescence.
De nos jours, FISH est largement utilisé comme outil de diagnostic clinique et est considéré comme l’étalon-or dans la détection des aberrations chromosomiques10. Dans le domaine de la médecine de la reproduction, l’analyse FISH sur le sperme a été utilisée pour mieux comprendre le contenu chromosomique X des spermatozoïdes chez les mâles présentant des aberrations chromosomiques numériques ou structurelles dans les cellules somatiques12,13,14. Ces études ont montré que les hommes présentant des aberrations chromosomiques étaient plus susceptibles d’avoir une fréquence plus élevée de spermatozoïdes aneuploïdes présents dans leur sperme par rapport aux hommes ayant des caryotypesnormaux 12,13,14.
Contrairement aux spermatozoïdes, on sait très peu de choses sur le contenu chromosomique X des cellules ovariennes (y compris les ovocytes, les cellules granulosa / thèques et les cellules stromales) chez les individus présentant une aberration chromosomique, ainsi que sur les conséquences possibles de l’aneuploïdie de ces cellules sur leur potentiel de reproduction. Une raison importante pour le peu d’informations sur le caryotype des cellules ovariennes par rapport aux spermatozoïdes est le fait que les femmes doivent subir une procédure invasive telle qu’une ponction de follicule ou une intervention chirurgicale pour obtenir des ovocytes ou du tissu du cortex ovarien. Les gamètes femelles sont donc difficiles à obtenir à des fins de recherche.
Actuellement, une étude d’intervention observationnelle est en cours aux Pays-Bas pour explorer l’efficacité de la cryoconservation du tissu ovarien chez les jeunes femmes atteintes de TS15. Un fragment du tissu du cortex ovarien de la patiente était disponible pour identifier le contenu chromosomique X des cellules ovariennes16,17. Dans le cadre de l’étude, une nouvelle méthode a été développée basée sur FISH du tissu dissocié du cortex ovarien pour déterminer si des aberrations chromosomiques sont présentes dans les cellules ovariennes chez les femelles porteuses d’une aberration chromosomique dans les cellules somatiques non ovariennes, telles que les lymphocytes ou les cellules buccales. En outre, l’effet de l’aneuploïdie dans les cellules ovariennes sur la folliculogenèse a également été déterminé. À cette fin, un protocole FISH établi a été modifié qui permet l’analyse de coupes histologiques de tissu du cortex ovarien après folliculogenèse induite artificiellement pendant la xénotransplantation à long terme chez des souris immunodéprimées. Dans cette étude, nous présentons deux méthodes basées sur FISH pour déterminer le contenu chromosomique X dans les cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé chez les femmes présentant des aberrations chromosomiques X, dans le but d’améliorer la science fondamentale sur ce sujet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Des millions de personnes dans le monde sont confrontées à des problèmes de fertilité. La baisse de la fertilité, voire l’infertilité, peut être due à de nombreuses causes différentes, y compris des troubles génétiques, dont les anomalies chromosomiques sont les plus courantes. L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode bien connue et fréquemment utilisée pour détecter les aberrations chromosomiques chez l’homme. FISH est principalement utilisé pour l’analyse des anomalies chromosomiques dans les spermatozoïdes des mâles présentant des aberrations chromosomiques numériques ou structurelles. En outre, cette technique est également fréquemment appliquée chez les femmes pour détecter les aberrations chromosomiques X connues pour causer la dysgénésie ovarienne. Cependant, les informations sur le contenu chromosomique X des cellules ovariennes de femelles présentant des aberrations chromosomiques X dans les lymphocytes et / ou les cellules buccales font encore défaut.
Le but de cette étude est de faire progresser la recherche fondamentale sur les aberrations chromosomiques X chez les femelles, en présentant deux méthodes basées sur FISH pour identifier le contenu chromosomique X des cellules ovariennes. Tout d’abord, une méthode est décrite pour déterminer le contenu chromosomique X de cellules ovariennes isolées (ovocytes, cellules de la granulosa et cellules stromales) dans le tissu du cortex ovarien non greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X. La deuxième méthode vise à évaluer l’effet des aberrations chromosomiques sur la folliculogenèse en déterminant le contenu chromosomique X des cellules ovariennes des follicules secondaires et antraux nouvellement formés dans le tissu ovarien, à partir de femelles présentant des aberrations chromosomiques X après greffe à long terme chez des souris immunodéprimées. Les deux méthodes pourraient être utiles dans les recherches futures pour mieux comprendre le potentiel de reproduction des femelles présentant des aberrations chromosomiques X.

FISH sur cellules ovariennes isolées avant la greffe Des tissus du cortex ovarien cryoconservés de femelles atteintes de 45,X/46,XX (patient A) ou 45,X/46,XX/47,XXX (patient B) TS ont été utilisés pour illustrer les résultats à l’aide de ce protocole. Chez le patient A, 50% des lymphocytes avaient un caryotype 45,X et 50% avaient 46,XX. Chez le patient B, 38% des lymphocytes étaient 45,X, 28% étaient 46,XX et 34% étaient 47,XXX. Des sondes spécifiques aux centromères pour le chromosome X...

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Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Cet article présente deux méthodes basées sur l’hybridation in situ par fluorescence pour déterminer le contenu chromosomique X des cellules ovariennes dans le tissu du cortex ovarien non greffé et greffé de femelles présentant des aberrations chromosomiques X.

Explorer les aberrations chromosomiques X dans les cellules ovariennes en utilisant l’hybridation in situ par fluorescence

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

L’analyse FISH de cellules ovariennes de femmes présentant des aberrations chromosomiques X est une technique unique pour mieux comprendre le contenu chromosomique X des cellules ovariennes de ce groupe spécifique. Ces techniques pourraient être utiles pour en apprendre davantage sur le potentiel de reproduction chez les femelles présentant des aberrations chromosomiques X. Il est important de mentionner que les deux méthodes sont destinées à faciliter les recherches futures et ne sont pas conçues pour être utilisées comme outil de diagnostic dans la pratique clinique.La procédure sera présentée par Ronald Peek, chercheur principal de notre laboratoire de fertilité, et Milad Intezar, analyste de notre département de pathologie. Pour commencer, coupez le tissu du cortex ovarien cryoconservé ou décongelé en petits morceaux d’un par un par un millimètre à l’aide d’un scalpel. Digérer enzymatiquement les fragments de tissu dans quatre litres de L15 préchauffé pendant 75 minutes à 37 degrés Celsius.Pipeter le mélange de digestion de haut en bas toutes les 15 minutes. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant quatre millilitres de L15 froide complétée par 10% de sérum bovin fœtal, ou FBS. Laver le tissu dissocié une fois avec huit millilitres de milieu L15 froid par centrifugation à 500 g avant de remettre en suspension dans 500 microlitres de milieu L15.Transférer la suspension cellulaire contenant en grande partie des cellules stromales individuelles et de petits follicules dans une boîte de Petri en plastique et examiner la suspension au stéréomicroscope. Prélevez manuellement les follicules de moins de 50 micromètres à l’aide d’une pipette en plastique de 75 micromètres et transférez-les dans la gouttelette de milieu L15 supplémentée avec 10% FBS à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez les follicules purifiés dans une solution de 0,06% de trypsine, un milligramme par millilitre d’EDTA et un milligramme par millilitre de glucose, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius.Après l’incubation, obtenir des cellules stromales ovariennes à partir de la suspension de cellules du cortex à l’aide d’une pipette en plastique de 75 micromètres. Pour l’hybridation in situ par fluorescence, ou l’analyse FISH de cellules ovariennes individuelles, transférer les follicules ovariens traités avec de la trypsine / EDTA / glucose, ou des cellules stromales à des gouttelettes de cinq microlitres de chlorure de potassium 0,15 millimolaire et 15 microlitres de DPBS sur une lame, et incuber pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius. Sécher et préfixer la lame dans 300 microlitres de chlorure de potassium 0,05 millimolaire, d’acide acétique à 7,5% et de méthanol à 22,5% pendant deux minutes.Couvrir la lame avec de l’acide acétique au méthanol trois pour un pendant deux minutes pour finaliser la fixation. Après la fixation, laver l’échantillon deux fois dans un SSC fraîchement préparé à 73 degrés Celsius. Couvrez-le de 100 microlitres de 2% de protéinase K et scellez-le avec un couvercle.Incuber la lame pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans la station d’hybridation. Après l’incubation, retirez le couvercle et lavez la lame pendant cinq minutes dans du DPBS à température ambiante sous agitation. Fixez l’échantillon pendant cinq minutes avec 1% de formaldéhyde.Ensuite, lavez la lame dans DPBS et déshydratez-la en série en augmentant les concentrations d’éthanol pendant deux minutes chacune. Sécher l’échantillon à l’air avant de l’hybrider avec des sondes marquées par fluorescence. Ensuite, ajoutez un microlitre de CEPX, un microlitre de CEP18 et 18 microlitres de tampon d’hybridation à l’échantillon et scellez avec un couvercle collé à la lame.Transférer la lame à la station d’hybridation pour une dénaturation à 73 degrés Celsius pendant trois minutes, suivie d’une hybridation pendant une nuit d’incubation à 37 degrés Celsius. Après l’hybridation, retirez le couvercle et toute colle restante de la lame. Lavez la lame dans 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 à 72 degrés Celsius pendant deux minutes, suivie d’une incubation pendant une minute dans 2X SSC et 0,1% Tween-20.Déshydratez la lame comme démontré et séchez-la à l’air libre dans l’obscurité avant de la recouvrir d’un support de montage contenant du DAPI. Placez la lame à moins 20 degrés Celsius pendant 10 minutes avant l’analyse par microscopie à fluorescence. Pour hybrider des sections de paraffine, sélectionnez de nouvelles sections avant ou après la section contenant les follicules du ruban de paraffine.Montez une section sur une lame de verre et séchez-la pendant 45 minutes sur un poêle à 56 degrés Celsius. Déparaffiner la section dans du xylène pendant 10 minutes, puis immerger la lame dans de l’éthanol à 99,5 % et la rincer pendant cinq minutes à l’eau du robinet. Prétraiter la lame avec la solution de récupération cible pendant 10 minutes à 96 degrés Celsius.Après refroidissement, rincer la lame à l’eau distillée. Traiter la lame pendant cinq minutes avec 0,01 molaire d’acide chlorhydrique, suivie d’une digestion de la pepsine pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Rincer à nouveau la lame dans de l’acide chlorhydrique, puis dans du PBS.Fixez la lame dans du PBS de formaldéhyde à 1% pendant cinq minutes. Ensuite, rincez brièvement la lame dans du PBS, puis à nouveau dans de l’eau déminéralisée avant de la déshydrater dans de l’éthanol à 99,5%. Appliquez cinq microlitres de sonde CEP18 et CEPX sur la lame prétraitée.Appliquez ensuite un bordereau de couverture et scellez la zone avec de la colle photo. Placez la lame dans un hybrideur pour la dénaturation à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes et l’hybridation pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, rincer la lame deux fois pendant cinq minutes chacune en SSC à 42 degrés Celsius, suivie d’un rinçage de deux minutes et d’une minute dans du Nonidet P-40 à 0,3% à 73 degrés Celsius.Encore une fois, rincer la lame dans 2X SSC suivie d’un rinçage à l’eau distillée avant de la déshydrater avec de l’éthanol à 99,5%. Séchez la glissière à l’air et montez-la dans un support de montage contenant du DAPI. Le tissu du cortex ovarien cryoconservé chez la patiente A a montré 50% des lymphocytes, avait un caryotype X 45, et 50% avait 46, XX.In patient B, 38% des lymphocytes étaient 45, X, 28% étaient 46, XX et 34% étaient 47, XXX.Les cellules stromales environnantes ont également été analysées pour le contenu chromosomique X. La digestion enzymatique du tissu du cortex ovarien a entraîné une suspension de cellules largement dissociées, mais laissant les follicules primordiaux, constitués d’un ovocyte intact entouré d’une seule couche de cellules de granulose. Les petits follicules ont fourni des difficultés dans l’interprétation des signaux après FISH, en raison de l’agglutination des cellules de la granulose.Une digestion supplémentaire des follicules avec de la trypsine avant FISH a entraîné la contraction des cellules de granulose individuelles dans une morphologie sphérique à la surface des follicules. La coloration à l’éosine d’hématoxyline a montré des follicules secondaires et antraux morphologiquement normaux dans le tissu du cortex ovarien après cinq mois de xénogrographie. Le contenu chromosomique X des cellules de granulose de ces follicules a été déterminé par analyse FISH.La fixation du tissu du cortex ovarien greffé dans la solution de Bouin a entraîné des signaux fluorescents flous et largement obscurcis dans les cellules folliculaires en raison d’une brume verte. En revanche, le tissu du cortex ovarien fixé dans le formaldéhyde a fourni d’excellents signaux fluorescents. Le principal défi de ce protocole réside dans l’isolement des cellules ovariennes et la digestion enzymatique du tissu.S’écarter de ce protocole peut entraîner une perte substantielle de cellules ovariennes au cours du processus, ce qui devrait être particulièrement évité chez les femmes qui ont déjà une faible réserve ovarienne. Un profilage supplémentaire de l’expression génique pourrait être utile pour en savoir plus sur l’impact des cellules ovariennes aneuploïdes sur la folliculogenèse, et donc le processus d’insuffisance ovarienne prématurée chez les femmes présentant des aberrations chromosomiques X.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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In Situ Étiquetage de l&#39; ADN mitochondrial de réplication chez la drosophile adulte Ovaires par EdU Coloration

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Recherche

Génétique

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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Optogénétiques mutagenèse aléatoire Utilisation Histone-miniSOG dans<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

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Analyse de la Aberrations chromosomiques Ambient particules induite par l&#39;aide d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; système

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

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Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (mFISH) et Spectral caryotype (SKY) chez des souris irradiées

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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Hybridation fluorescente In Situ haute résolution dans des embryons de drosophile et tissus à l’aide d’Amplification de Signal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

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Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Hybridation In Situ de Fluorescence de la molécule unique (smFISH) analyse en bourgeonnement levure croissance végétative et la méiose

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Tissu-spécifique miRNA, profilage de l’Expression à l’aide de la souris coeur Sections en hybridation in Situ

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