Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Die Autoren danken Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef und Milan Intezar für ihr Fachwissen und ihre technische Unterstützung. Finanzierungsquellen: Merck Serono (A16-1395), Goodlife und Ferring.

Das Studienprotokoll von TurnerFertility wurde vom Zentralausschuss für Forschung am Menschen genehmigt (NL57738.000.16). In dieser Studie wurde das Gewebe der Ovarialrinde von 93 Frauen mit TS gewonnen. Materialien, für die Sicherheitsvorkehrungen erforderlich sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Sicherheitsvorkehrungen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Material</...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

Die FISH-Analyse ist eine bekannte Technik zum Nachweis von X-Chromosomenaberrationen in Lymphozyten oder Wangenzellen sowohl von Männern als auch von Frauen10. Mehrere Studien haben FISH an Gameten von Männern mit X-Chromosomenaberrationen beschrieben, aber es fehlen noch detaillierte Informationen, die FISH an Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen gewonnen hat14. In diesem Artikel werden neue Methoden vorgestellt, die auf FISH basieren, um festzustell...

Unfruchtbarkeit ist ein Gesundheitsproblem des männlichen oder weiblichen Fortpflanzungssystems, von dem weltweit etwa 186 Millionen Menschen im gebärfähigen Alter betroffen sind1. Bei mindestens 35 % der unfruchtbaren Paare wird die Unfruchtbarkeit durch eine Störung des weiblichen Fortpflanzungssystems verursacht2. Es gibt viele Faktoren, die weibliche Unfruchtbarkeit verursachen können, wie z. B. genetische Faktoren, Anomalien des Genitaltrakts, endokrine Dysfunktion, entzündliche Erkrankungen und iatrogene Behandlung3.
Genetische Anomalien liegen bei etwa 10 % der unfruchtbaren Frauen vor 4,5. Von allen genetischen Anomalien sind X-Chromosomen-Aberrationen die häufigste Ursache für die Ovarialdysgenesie2. Mehrere Studien haben berichtet, dass X-Chromosomenaberrationen bei Frauen mit Turner-Syndrom (TS) oder Triple-X-Syndrom mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz aufgrund eines beschleunigten Verlusts von Keimzellen oder einer gestörten Oogenese assoziiert sind 6,7,8.
Aberrationen des X-Chromosoms können unterteilt werden in: 1) numerische Aberrationen, bei denen die Anzahl der X-Chromosomen unterschiedlich ist, aber die X-Chromosomen intakt sind; und 2) strukturelle Aberrationen, bei denen das X-Chromosom genetisches Material gewonnen oder verloren hat 3,9. Numerische Aberrationen des X-Chromosoms sind häufiger als strukturelle Anomalien und werden häufig durch spontane Fehler bei der Zellteilung verursacht 3,9. Wenn ein solcher Fehler während der Meiose auftritt, kann er zu aneuploiden Gameten und schließlich zu Nachkommen mit Chromosomenaberrationen in allen Zellen führen. Wenn Chromosomendefekte in somatischen Zellen als Folge von Fehlern während der Mitose in frühen Stadien der Ontogenese auftreten, kann dies zu Mosaizismus führen. Bei diesen Personen sind sowohl Zellen mit normalem X-Chromosomengehalt als auch Zellen mit X-Chromosomenaberrationen vorhanden.
In den 1980er Jahren wurde eine zytogenetische Technik namens Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) entwickelt, um spezifische Nukleinsäuresequenzen auf Metaphase- und Interphase-Chromosomen sichtbar zu machen und zu lokalisieren 10,11. Bei dieser Technik werden fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden verwendet, um an eine bestimmte Sequenz im Chromosom zu binden, die dann mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden kann.
Heutzutage ist FISH als klinisches Diagnoseinstrument weit verbreitet und gilt als Goldstandard bei der Erkennung von Chromosomenaberrationen10. Im Bereich der Reproduktionsmedizin wurde die FISH-Analyse an Spermien eingesetzt, um Einblicke in den X-chromosomalen Gehalt von Spermien bei Männern mit numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen in somatischen Zellen zu erhalten12,13,14. Diese Studien zeigten, dass Männer mit Chromosomenaberrationen mit größerer Wahrscheinlichkeit eine höhere Häufigkeit von aneuploiden Spermien in ihrem Sperma aufwiesen als Männer mit normalen Karyotypen12,13,14.
Im Gegensatz zu den Spermien ist nur sehr wenig über den X-chromosomalen Gehalt von Eierstockzellen (einschließlich Eizellen, Granulosa/Theka-Zellen und Stromazellen) bei Personen mit einer Chromosomenaberration sowie über die möglichen Folgen einer Aneuploidie dieser Zellen auf ihr Fortpflanzungspotenzial bekannt. Ein wichtiger Grund für die geringen Informationen über den Karyotyp von Eierstockzellen im Vergleich zu Spermien ist die Tatsache, dass sich Frauen einem invasiven Eingriff wie einer Follikelpunktion oder einer Operation unterziehen müssen, um Eizellen oder Gewebe der Eierstockrinde zu gewinnen. Weibliche Gameten sind daher für Forschungszwecke nur schwer zu beschaffen.
Derzeit wird in den Niederlanden eine Interventionsstudie durchgeführt, um die Wirksamkeit der Kryokonservierung von Eierstockgewebe bei jungen Frauen mit TS15 zu untersuchen. Ein Fragment des Gewebes der Ovarialrinde der Patientin stand zur Verfügung, um den X-chromosomalen Gehalt der Ovarialzellen zu bestimmen16,17. Im Rahmen der Studie wurde eine neuartige Methode entwickelt, die auf FISH von dissoziiertem Ovarialrindengewebe basiert, um festzustellen, ob Chromosomenaberrationen in Ovarialzellen bei Frauen vorhanden sind, die eine Chromosomenaberration in nicht-ovariellen somatischen Zellen wie Lymphozyten oder Wangenzellen aufweisen. Darüber hinaus wurde auch der Effekt der Aneuploidie in Ovarialzellen auf die Follikulogenese bestimmt. Zu diesem Zweck wurde ein etabliertes FISH-Protokoll modifiziert, das die Analyse histologischer Schnitte von Ovarialrindengewebe nach künstlich induzierter Follikulogenese während der Langzeit-Xenotransplantation bei immungeschwächten Mäusen ermöglicht. In dieser Studie stellen wir zwei auf FISH basierende Methoden vor, um den X-chromosomalen Gehalt in Ovarialzellen in nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe bei Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen, mit dem Ziel, die Grundlagenforschung zu diesem Thema zu verbessern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Millionen von Menschen weltweit beschäftigen sich mit Fragen der Fruchtbarkeit. Eine verminderte Fruchtbarkeit oder sogar Unfruchtbarkeit kann auf viele verschiedene Ursachen zurückzuführen sein, einschließlich genetischer Störungen, von denen Chromosomenanomalien die häufigsten sind. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine bekannte und häufig eingesetzte Methode zum Nachweis von Chromosomenaberrationen beim Menschen. FISH wird hauptsächlich für die Analyse von Chromosomenanomalien in den Spermien von Männern mit numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen verwendet. Darüber hinaus wird diese Technik auch häufig bei Frauen angewendet, um X-Chromosomenaberrationen zu erkennen, von denen bekannt ist, dass sie eine ovarielle Dysgenesie verursachen. Es fehlen jedoch noch Informationen über den X-Chromosomen-Gehalt von Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen in Lymphozyten und/oder Wangenzellen.
Ziel dieser Studie ist es, die Grundlagenforschung zu X-Chromosomenaberrationen bei Frauen voranzutreiben, indem zwei auf FISH basierende Methoden zur Bestimmung des X-chromosomalen Gehalts von Ovarialzellen vorgestellt werden. Zunächst wird eine Methode beschrieben, mit der der X-Chromosomengehalt von isolierten Ovarialzellen (Eizellen, Granulosazellen und Stromazellen) in nicht transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen bestimmt werden kann. Die zweite Methode zielt darauf ab, die Wirkung von Chromosomenaberrationen auf die Follikulogenese zu bewerten, indem der X-Chromosomengehalt von Eierstockzellen neu gebildeter sekundärer und antraler Follikel im Eierstockgewebe von Weibchen mit X-Chromosomenaberrationen nach Langzeittransplantation in immungeschwächte Mäuse bestimmt wird. Beide Methoden könnten in der zukünftigen Forschung hilfreich sein, um Einblicke in das Fortpflanzungspotenzial von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erhalten.

FISH auf isolierten Eierstockzellen vor der Transplantation Kryokonserviertes Ovarialrindengewebe von Frauen mit 45,X/46,XX (Patientin A) oder 45,X/46,XX/47,XXX (Patientin B) TS wurde verwendet, um die Ergebnisse mit diesem Protokoll zu veranschaulichen. Bei Patient A wiesen 50% der Lymphozyten einen 45,X-Karyotyp und 50% einen 46,XX-Karyotyp auf. Bei Patient B waren 38% der Lymphozyten 45,X, 28% 46,XX und 34% 47,XXX. Zentromerspezifische Sonden für Chromosom X (grün) und Chromosom 18 als Kontrolle ...

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Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In diesem Artikel werden zwei Methoden vorgestellt, die auf der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung basieren, um den X-chromosomalen Gehalt von Ovarialzellen in nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen.

Erforschung von X-Chromosomen-Aberrationen in Ovarialzellen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

Die FISH-Analyse von Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen ist eine einzigartige Technik, um Einblicke in den X-Chromosomengehalt von Eierstockzellen in dieser speziellen Gruppe zu erhalten. Diese Techniken könnten hilfreich sein, um mehr über das Fortpflanzungspotenzial von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erfahren. Es ist wichtig zu erwähnen, dass beide Methoden die zukünftige Forschung erleichtern sollen und nicht als diagnostisches Werkzeug in der klinischen Praxis konzipiert sind.Das Verfahren wird von Ronald Peek, einem leitenden Forscher unseres Fruchtbarkeitslabors, und Milad Intezar, einem Analysten unserer Pathologieabteilung, demonstriert. Schneiden Sie zunächst das kryokonservierte oder aufgetaute Gewebe der Eierstockrinde mit einem Skalpell in kleine Stücke von einem Millimeter nach dem anderen. Die Gewebefragmente in vier Litern vorgewärmtem L15 75 Minuten bei 37 Grad Celsius enzymatisch verdauen.Pipettieren Sie die Verdauungsmischung alle 15 Minuten auf und ab. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie vier Milliliter kaltes L15 hinzufügen, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) ergänzt wird. Waschen Sie das dissoziierte Gewebe einmal mit acht Millilitern kaltem L15-Medium durch Zentrifugation bei 500 g, bevor es in 500 Mikrolitern L15-Medium resuspendiert wird.Die Zellsuspension, die größtenteils einzelne Stromazellen und kleine Follikel enthält, wird in eine Petrischale aus Kunststoff überführt und unter dem Stereomikroskop untersucht. Entnahme der Follikel mit einer Größe von weniger als 50 Mikrometern manuell mit einer 75-Mikrometer-Kunststoffpipette und übertragen Sie sie bei vier Grad Celsius in das Tröpfchen L15-Medium, das mit 10 % FBS angereichert ist. Übertragen Sie dann die gereinigten Follikel in eine Lösung mit 0,06 % Trypsin, einem Milligramm pro Milliliter EDTA und einem Milligramm pro Milliliter Glukose und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Nach der Inkubation werden mit einer 75 Mikrometer langen Kunststoffpipette ovarielle Stromazellen aus der Suspension der Kortexzellen gewonnen. Für die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung oder FISH-Analyse einzelner Eierstockzellen werden die behandelten Eierstockfollikel mit Trypsin/EDTA/Glukose oder Stromazellen in Tröpfchen von fünf Mikrolitern 0,15 millimolarem Kaliumchlorid und 15 Mikrolitern DPBS auf einem Objektträger übertragen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Trocknen und fixieren Sie den Objektträger zwei Minuten lang in 300 Mikrolitern 0,05 millimolar Kaliumchlorid, 7,5 % Essigsäure und 22,5 % Methanol.Decken Sie den Objektträger zwei Minuten lang mit drei zu eins Methanolessigsäure ab, um die Fixierung abzuschließen. Nach der Fixierung waschen Sie die Probe zweimal in frisch zubereitetem SSC bei 73 Grad Celsius. Decken Sie es mit 100 Mikrolitern 2%Proteinase K ab und verschließen Sie es mit einem Deckglas.Inkubieren Sie den Objektträger für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Hybridisierungsstation. Entfernen Sie nach der Inkubation das Deckglas und waschen Sie den Objektträger fünf Minuten lang in DPBS bei Raumtemperatur unter Schütteln. Fixieren Sie die Probe fünf Minuten lang mit 1%igem Formaldehyd.Waschen Sie dann den Objektträger in DPBS und dehydrieren Sie ihn seriell in steigenden Ethanolkonzentrationen für jeweils zwei Minuten. Trocknen Sie die Probe an der Luft, bevor Sie sie mit fluoreszenzmarkierten Sonden hybridisieren. Als nächstes geben Sie einen Mikroliter CEPX, einen Mikroliter CEP18 und 18 Mikroliter des Hybridisierungspuffers in die Probe und verschließen Sie sie mit einem Deckglas, das auf den Objektträger geklebt wird.Überführen Sie den Objektträger zur Denaturierung bei 73 Grad Celsius für drei Minuten in die Hybridisierungsstation, gefolgt von der Hybridisierung während einer Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Hybridisierung das Deckglas und den restlichen Kleber vom Objektträger. Waschen Sie den Objektträger zwei Minuten lang in 0,4-fachem SSC, 0,3 % Tween-20 bei 72 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubationsminute für eine Minute in 2-fachem SSC und 0,1 % Tween-20.Dörren Sie den Objektträger wie gezeigt und trocknen Sie ihn im Dunkeln an der Luft, bevor Sie ihn mit einem Eindeckmedium abdecken, das DAPI enthält. Legen Sie den Objektträger für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius ab, bevor Sie ihn fluoreszenzmikroskopisch analysieren. Um Paraffinschnitte zu hybridisieren, wählen Sie neue Schnitte vor oder nach dem Schnitt aus, der Follikel aus dem Paraffinband enthält.Montieren Sie einen Abschnitt auf einem Objektträger und trocknen Sie ihn 45 Minuten lang auf einem Herd bei 56 Grad Celsius. Entparaffinieren Sie den Abschnitt 10 Minuten lang in Xylol, tauchen Sie den Objektträger dann in 99,5%iges Ethanol und spülen Sie ihn fünf Minuten lang in Leitungswasser ab. Behandeln Sie den Objektträger 10 Minuten lang bei 96 Grad Celsius mit der Zielrückhollösung vor.Spülen Sie den Objektträger nach dem Abkühlen in destilliertem Wasser ab. Behandeln Sie den Objektträger fünf Minuten lang mit 0,01 molarer Salzsäure, gefolgt von einer Pepsinverdauung für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie den Objektträger erneut in Salzsäure und anschließend in PBS ab.Fixieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in 1%igem Formaldehyd-PBS. Spülen Sie den Objektträger dann kurz in PBS und erneut in demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie ihn in 99,5%igem Ethanol dehydrieren. Tragen Sie fünf Mikroliter Sonde CEP18 und CEPX auf den vorbehandelten Objektträger auf.Bringen Sie dann ein Deckglas an und versiegeln Sie die Stelle mit Fotokleber. Legen Sie den Objektträger zur Denaturierung bei 80 Grad Celsius für 10 Minuten und zur Hybridisierung über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen Hybridisator. Spülen Sie den Objektträger am nächsten Tag zweimal für jeweils fünf Minuten in SSC bei 42 Grad Celsius, gefolgt von einer zweiminütigen und einer einminütigen Spülung in 0,3%Nonidet P-40 bei 73 Grad Celsius.Spülen Sie den Objektträger erneut in 2X SSC und anschließend in destilliertem Wasser ab, bevor Sie ihn mit 99,5 % Ethanol dehydrieren. Trocknen Sie den Objektträger an der Luft und montieren Sie ihn in einem DAPI-haltigen Eindeckmedium. Kryokonserviertes Ovarialrindengewebe bei Patientin A zeigte 50 % der Lymphozyten, einen 45-X-Karyotyp und 50 % 46, XX.In Patientin B waren 38 % der Lymphozyten 45, X, 28 % waren 46, XX und 34 % waren 47, XXX.Umliegende Stromazellen wurden ebenfalls auf ihren X-Chromosomengehalt untersucht. Die enzymatische Verdauung des Gewebes der Ovarialrinde führte zu einer Suspension weitgehend dissoziierter Zellen, wobei jedoch die primordialen Follikel übrig blieben, die aus einer intakten Eizelle bestanden, die von einer einzigen Schicht von Granulosezellen umgeben war. Kleine Follikel erschwerten die Interpretation von Signalen nach FISH, was auf die Verklumpung der Granulosezellen zurückzuführen war.Eine zusätzliche Verdauung der Follikel mit Trypsin vor FISH führte dazu, dass sich einzelne Granulosezellen zu einer kugelförmigen Morphologie auf der Oberfläche der Follikel zusammenzogen. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte morphologisch normale sekundäre und antrale Follikel im Gewebe der Ovarialrinde nach fünfmonatiger Xenotransplantation. Der X-chromosomale Gehalt der Granulosezellen dieser Follikel wurde mittels FISH-Analyse bestimmt.Die Fixierung von transplantiertem Gewebe der Eierstockrinde in Bouin-Lösung führte zu verschwommenen und weitgehend verdeckten Fluoreszenzsignalen in Follikelzellen aufgrund einer grünen Trübung. Im Gegensatz dazu lieferte das in Formaldehyd fixierte Gewebe der Eierstockrinde hervorragende Fluoreszenzsignale. Die größte Herausforderung dieses Protokolls liegt in der Isolierung von Eierstockzellen und der enzymatischen Verdauung des Gewebes.Eine Abweichung von diesem Protokoll kann zu einem erheblichen Verlust von Eierstockzellen während des Prozesses führen, was insbesondere bei Frauen vermieden werden sollte, die bereits über eine geringe Eierstockreserve verfügen. Zusätzliche Genexpressionsprofile könnten hilfreich sein, um mehr über den Einfluss aneuploider Ovarialzellen auf die Follikulogenese und damit über den Prozess der vorzeitigen Ovarialinsuffizienz bei Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erfahren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Forschung

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

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Der Nachweis von Inter-chromosomale Stable Abberationen durch Mehrfachfluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung (MFISH) und Spektrale Karyotypisierung (SKY) in Bestrahlte Mäuse

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

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Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

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Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...