Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef og Milan Intezar for deres ekspertise og tekniske assistanse. Finansieringskilder: Merck Serono (A16-1395), Goodlife og Ferring.

TurnerFertility-studieprotokollen er godkjent av Central Committee on Research Involving Human Subjects (NL57738.000.16). I denne studien ble ovariecortexvevet hos 93 kvinner med TS oppnådd. Materialer som krever sikkerhetstiltak er listet opp i tabell 1.
Tabell 1: Sikkerhetsregler.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Materiale</td>
			<td colspan="3">Fare</stron...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

FISH-analyse er en velkjent teknikk for å påvise X-kromosomavvik i lymfocytter eller bukkalceller hos både hanner og hunner10. Flere studier har beskrevet FISH på kjønnsceller fra hanner med X-kromosomavvik, men detaljert informasjon innhentet av FISH på eggstokkceller fra hunner med X-kromosomavvik mangler fortsatt14. Denne artikkelen presenterer nye metoder basert på FISH for å avgjøre om aneuploidi er tilstede i eggstokkceller av ikke-podet og podet ovariecortex...

Infertilitet er et helseproblem av det mannlige eller kvinnelige reproduktive systemet, som påvirker omtrent 186 millioner individer i reproduktiv alder over hele verden1. I minst 35% av infertile par er infertilitet forårsaket av en lidelse i det kvinnelige reproduktivesystemet. Det er mange faktorer som kan forårsake kvinnelig infertilitet, for eksempel genetiske faktorer, kjønnsorganer, endokrin dysfunksjon, inflammatoriske sykdommer og iatrogen behandling3.
Genetiske abnormiteter er tilstede hos ca 10% av infertile kvinner 4,5. Av alle genetiske abnormiteter er X-kromosomavvik den vanligste årsaken til ovarial dysgenese2. Flere studier har rapportert at X-kromosomavvik hos kvinner med Turners syndrom (TS) eller Triple X-syndrom er assosiert med for tidlig eggstokksvikt på grunn av et akselerert tap av kimceller eller nedsatt oogenese 6,7,8.
Aberrasjoner av X-kromosomet kan deles inn i: 1) numeriske avvik, hvor antall X-kromosomer er forskjellige, men X-kromosomene er intakte; og 2) strukturelle avvik, der X-kromosomet har fått eller mistet genetisk materiale 3,9. Numeriske avvik i X-kromosomet er vanligere enn strukturelle avvik og skyldes ofte spontane feil under celledeling 3,9. Når en slik feil oppstår under meiose, kan det føre til aneuploide gameter og til slutt til avkom med kromosomale avvik i alle celler. Når kromosomdefekter oppstår i somatiske celler som følge av feil som oppstår under mitose i de tidlige stadier av ontogenese, kan det føre til mosaikk. Hos disse individene er både celler med normalt X-kromosominnhold og celler med X-kromosomavvik til stede.
På 1980-tallet ble en cytogenetisk teknikk kalt fluorescens in situ hybridisering (FISH) utviklet for å visualisere og lokalisere spesifikke nukleinsyresekvenser på metafase- og interfasekromosomer10,11. Denne teknikken bruker fluorescerende merkede DNA-prober for å binde seg til en bestemt sekvens i kromosomet, som deretter kan visualiseres ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
I dag er FISH mye brukt som et klinisk diagnostisk verktøy og regnes som gullstandarden for å oppdage kromosomavvik10. Innen reproduksjonsmedisin har FISH-analyse på sædceller blitt brukt for å få innsikt i X-kromosominnholdet i spermatozoer hos menn med numeriske eller strukturelle kromosomavvik i somatiske celler12,13,14. Disse studiene viste at menn med kromosomavvik var mer sannsynlig å ha en høyere frekvens av aneuploide spermatozoer tilstede i sæden sammenlignet med menn med normale karyotyper12,13,14.
I motsetning til spermatozoer er svært lite kjent om X-kromosominnholdet i eggstokkceller (inkludert oocytter, granulosa / theca-celler og stromale celler) hos individer med kromosomavvik, samt de mulige konsekvensene av aneuploidi av disse cellene på deres reproduktive potensial. En viktig årsak til den knappe informasjonen om karyotypen av eggstokkceller sammenlignet med spermatozoa er det faktum at kvinner må gjennomgå en invasiv prosedyre som en follikelpunktering eller kirurgi for å oppnå oocytter eller eggstokkvev. Kvinnelige kjønnsceller er derfor vanskelig å få tak i for forskningsformål.
For tiden utføres en observasjonsintervensjonsstudie i Nederland for å undersøke effekten av kryopreservering av eggstokkvev hos unge kvinner med TS15. Ett fragment av ovariecortexvevet til pasienten var tilgjengelig for å identifisere X-kromosominnholdet i eggstokkcellene16,17. Som en del av studien ble det utviklet en ny metode basert på FISH av dissociert ovariecortexvev for å avgjøre om kromosomale avvik er tilstede i eggstokkceller hos kvinner som bærer en kromosomavvik i ikke-ovarie somatiske celler, som lymfocytter eller bukkalceller. I tillegg ble effekten av aneuploidi i eggstokkceller på follikulogenese også bestemt. For dette formål ble en etablert FISH-protokoll modifisert som muliggjør analyse av histologiske seksjoner av ovariecortexvev etter kunstig indusert follikulogenese under langvarig xenotransplantasjon hos immunkompromitterte mus. I denne studien presenterer vi to metoder basert på FISH for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev hos kvinner med X-kromosomavvik, med sikte på å forbedre grunnleggende vitenskap om dette emnet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Millioner av mennesker over hele verden håndterer problemer knyttet til fruktbarhet. Redusert fruktbarhet, eller til og med infertilitet, kan skyldes mange forskjellige årsaker, inkludert genetiske lidelser, hvorav kromosomale abnormiteter er de vanligste. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en velkjent og hyppig brukt metode for å oppdage kromosomavvik hos mennesker. FISH brukes hovedsakelig til analyse av kromosomale abnormiteter i spermatozoa hos menn med numeriske eller strukturelle kromosomavvik. Videre er denne teknikken også ofte brukt hos kvinner for å oppdage X-kromosomale avvik som er kjent for å forårsake ovarial dysgenese. Det mangler imidlertid fortsatt informasjon om X-kromosominnholdet i ovarieceller fra hunner med X-kromosomavvik i lymfocytter og/eller bukkalceller.
Målet med denne studien er å fremme grunnforskning angående X-kromosomavvik hos kvinner, ved å presentere to metoder basert på FISH for å identifisere X-kromosominnholdet i eggstokkceller. Først beskrives en metode for å bestemme X-kromosominnholdet i isolerte eggstokkceller (oocytter, granulosaceller og stromale celler) i ikke-podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik. Den andre metoden er rettet mot å evaluere effekten av kromosomale avvik på follikulogenese ved å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller av nydannede sekundære og antralfollikler i eggstokkvev, fra kvinner med X-kromosomale avvik etter langvarig podning i immunkompromitterte mus. Begge metodene kan være nyttige i fremtidig forskning for å få innsikt i reproduksjonspotensialet til kvinner med X-kromosomavvik.

FISH på isolerte eggstokkceller før poding Kryopreservert ovariecortexvev fra kvinner med 45,X/46,XX (pasient A) eller 45,X/46,XX/47,XXX (pasient B) TS ble brukt for å illustrere resultatene ved hjelp av denne protokollen. Hos pasient A hadde 50 % av lymfocyttene en 45,X karyotype og 50 % hadde 46,XX. Hos pasient B var 38 % av lymfocyttene 45,X, 28 % var 46,XX og 34 % var 47,XXX. Sentromerspesifikke sonder for kromosom X (grønn) og kromosom 18 som kontroll (rød) ble brukt til å bestemme X-kromos...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Denne artikkelen presenterer to metoder basert på fluorescens in situ hybridisering for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik.

Utforske X-kromosomale avvik i eggstokkceller ved å bruke fluorescens in situ hybridisering

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

FISH-analyse av eggstokkceller fra hunner med X-kromosomavvik er en unik teknikk for å få innsikt i X-kromosominnholdet i eggstokkceller i denne spesifikke gruppen. Disse teknikkene kan være nyttige for å lære mer om reproduksjonspotensial hos kvinner med X-kromosomavvik. Det er viktig å nevne at begge metodene er ment å legge til rette for fremtidig forskning, og ikke er laget for å brukes som et diagnostisk verktøy i klinisk praksis.Demonstrere prosedyren vil være Ronald Peek, seniorforsker fra vårt fruktbarhetslaboratorium, og Milad Intezar, en analytiker fra vår patologiavdeling. For å begynne, kutt kryopreservert eller tint eggstokkvev i små biter av en etter en millimeter ved hjelp av en skalpell. Fordøy enzymatisk vevfragmentene i fire liter forvarmet L15 i 75 minutter ved 37 grader Celsius.Pipetter fordøyelsesblandingen opp og ned hvert 15. minutt. Stopp enzymatisk fordøyelse ved å legge til fire milliliter kald L15 supplert med 10%Fetal Bovine Serum, eller FBS. Vask det dissosierte vevet en gang med åtte milliliter kaldt L15-medium ved sentrifugering ved 500 g før du suspenderer i 500 mikroliter L15 medium.Overfør cellesuspensjonen som hovedsakelig inneholder individuelle stromale celler og små follikler til en petriskål av plast, og undersøk suspensjonen under et stereomikroskop. Velg folliklene mindre enn 50 mikrometer i størrelse manuelt ved hjelp av en 75 mikrometer plastpipette, og overfør dem til dråpen L15 medium supplert med 10% FBS ved fire grader Celsius. Overfør deretter de rensede folliklene til en løsning på 0,06% trypsin, ett milligram per milliliter EDTA og ett milligram per milliliter glukose, og inkuber i 20 minutter ved 37 grader Celsius.Etter inkubering, oppnå ovarie stromale celler fra cortex celle suspensjon ved hjelp av en 75 mikrometer plastpipette. For fluorescens in situ hybridisering, eller FISH-analyse av individuelle eggstokkceller, overfør de behandlede eggstokkfolliklene med trypsin / EDTA / glukose eller stromale celler til dråper på fem mikroliter 0,15 millimolært kaliumklorid og 15 mikroliter DPBS på et lysbilde, og inkuber i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Tørk og prefikser lysbildet i 300 mikroliter 0,05 millimolært kaliumklorid, 7,5% eddiksyre og 22,5% metanol i to minutter.Dekk lysbildet med tre-til-en metanolddiksyre i to minutter for å fullføre fiksering. Etter fiksering, vask prøven to ganger i nylaget SSC ved 73 grader Celsius. Dekk den med 100 mikroliter 2% Proteinase K og forsegl den med et deksel.Inkuber lysbildet i 10 minutter ved 37 grader Celsius i hybridiseringsstasjonen. Etter inkubering, fjern dekselet og vask lysbildet i fem minutter i DPBS ved romtemperatur under risting. Fest prøven i fem minutter med 1% formaldehyd.Vask deretter lysbildet i DPBS, og dehydrer det serielt i økende etanolkonsentrasjoner i to minutter hver. Lufttørk prøven før du hybridiserer den med fluorescerende merkede sonder. Deretter tilsettes en mikroliter CEPX, en mikroliter CEP18 og 18 mikroliter hybridiseringsbufferen til prøven og forsegles med et deksel som limes til lysbildet.Overfør lysbildet til hybridiseringsstasjonen for denaturering ved 73 grader Celsius i tre minutter, etterfulgt av hybridisering under en nattlig inkubasjon ved 37 grader Celsius. Etter hybridisering, fjern dekselet og gjenværende lim fra lysbildet. Vask lysbildet i 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 ved 72 grader Celsius i to minutter, etterfulgt av inkubasjon i ett minutt i 2X SSC og 0,1% Tween-20.Dehydrer lysbildet som demonstrert, og lufttørk det i mørket før det dekkes med et monteringsmedium som inneholder DAPI. Plasser lysbildet på minus 20 grader Celsius i 10 minutter før analyse ved fluorescensmikroskopi. For å hybridisere parafinseksjoner, velg nye seksjoner før eller etter seksjonen som inneholder follikler fra parafinbåndet.Monter en seksjon på en glassglass, og tørk den i 45 minutter på en komfyr ved 56 grader Celsius. Deparaffiniser seksjonen i xylen i 10 minutter, senk deretter lysbildet i 99,5% etanol, og skyll det i fem minutter i vann fra springen. Forbehandle lysbildet med målgjenfinningsløsningen i 10 minutter ved 96 grader Celsius.Etter avkjøling, skyll lysbildet i destillert vann. Behandle lysbildet i fem minutter med 0,01 molar saltsyre, etterfulgt av pepsinfordøyelse i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Skyll lysbildet igjen i saltsyre og deretter i PBS.Fest lysbildet i 1% formaldehyd PBS i fem minutter. Skyll deretter lysbildet kort i PBS, og igjen i demineralisert vann før du dehydrerer det i 99,5% etanol. Påfør fem mikroliter sonde CEP18 og CEPX på det ferdigbehandlede lysbildet.Påfør deretter et deksel og forsegl området med fotolim. Plasser lysbildet i en hybridisator for denaturering ved 80 grader Celsius i 10 minutter og hybridisering over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag, skyll lysbildet to ganger i fem minutter hver i SSC ved 42 grader Celsius, etterfulgt av en to minutter og ett minutt skyll i 0,3% Nonidet P-40 ved 73 grader Celsius.Skyll igjen lysbildet i 2X SSC etterfulgt av skylling i destillert vann før du dehydrerer det med 99,5% etanol. Lufttørk lysbildet, og monter det i et DAPI-holdig monteringsmedium. Kryopreservert ovariecortexvev hos pasient A viste 50 % av lymfocyttene, hadde en 45, X karyotype og 50 % hadde 46, XX.In pasient B var 38 % av lymfocyttene 45, X, 28 % var 46, XX og 34 % var 47, XXX.Omkringliggende stromale celler ble også analysert for X-kromosominnhold. Enzymatisk fordøyelse av ovariecortexvev resulterte i en suspensjon av stort sett dissosierte celler, men forlot de primordiale folliklene, bestående av en intakt oocytt omgitt av et enkelt lag av granuloseceller. Små follikler ga vanskeligheter med å tolke signaler etter FISH, på grunn av sammenklumping av granulosecellene.Ytterligere fordøyelse av folliklene med trypsin før FISH resulterte i at individuelle granuloseceller trakk seg sammen til en sfærisk morfologi på overflaten av folliklene. Farging av hematoksylineosin viste morfologisk normale sekundær- og antralfollikler i ovariecortexvev etter fem måneders xenotransplantasjon. X-kromosominnholdet i granulosecellene i disse folliklene ble bestemt ved FISH-analyse.Fiksering av podet ovariecortexvev i Bouin-oppløsning resulterte i uskarpe og stort sett skjulte fluorescerende signaler i follikulære celler på grunn av en grønn dis. I motsetning til dette ga ovariecortexvev fiksert i formaldehyd gode fluorescerende signaler. Hovedutfordringen med denne protokollen ligger i isolering av eggstokkceller og enzymatisk fordøyelse av vevet.Avvik fra denne protokollen kan føre til et betydelig tap av eggstokkceller under prosessen, og dette bør spesielt unngås hos kvinner som allerede har lav eggstokkreserve. Ytterligere genuttrykksprofilering kan være nyttig for å lære mer om virkningen av aneuploide eggstokkceller på follikulogenese, og dermed prosessen med for tidlig eggstokksvikt hos kvinner med X-kromosomavvik.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Merking av mitokondriell DNA replikasjon i Drosophila voksen Eggstokkene Edu Farging

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenese Bruke Histone-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Påvisning av Inter-kromosom Stabil Avvik ved Multiple fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) og Spectral karyotypering (SKY) i Bestrålet Mus

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Ett molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analyse i spirende gjær vegetativ vekst og meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...