Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Os autores agradecem a Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef e Milan Intezar por sua experiência e assistência técnica. Fontes de financiamento: Merck Serono (A16-1395), Goodlife e Ferring.

O protocolo do estudo TurnerFertility foi aprovado pelo Comitê Central de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (NL57738.000.16). Neste estudo, o tecido do córtex ovariano de 93 fêmeas com ST foi obtido. Os materiais que requerem precauções de segurança estão listados na Tabela 1.
Tabela 1: Precauções de segurança.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Material</td>
	...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

A análise de FISH é uma técnica bem conhecida para detectar aberrações cromossômicas X em linfócitos ou células bucais de homens e mulheres10. Vários estudos descreveram FISH em gametas de machos com aberrações cromossômicas X, mas informações detalhadas obtidas por FISH em células ovarianas de fêmeas com aberrações cromossômicas X ainda são escassas14. Este artigo apresenta novos métodos baseados em FISH para determinar se aneuploidias estão presentes...

A infertilidade é um problema de saúde do sistema reprodutor masculino ou feminino, afetando aproximadamente 186 milhões de indivíduos em idade reprodutiva no mundo1. Em pelo menos 35% dos casais inférteis, a infertilidade é causada por um distúrbio do sistema reprodutor feminino2. Vários são os fatores que podem causar a infertilidade feminina, como fatores genéticos, anormalidades do trato genital, disfunção endócrina, doenças inflamatórias e tratamento iatrogênico3.
Anormalidades genéticas estão presentes em aproximadamente 10% das fêmeas inférteis 4,5. De todas as anormalidades genéticas, as aberrações do cromossomo X são a causa mais comum de disgenesia ovariana2. Vários estudos relatam que aberrações cromossômicas X em mulheres com síndrome de Turner (ST) ou síndrome do triplo X estão associadas à falência ovariana prematura devido à perda acelerada de células germinativas ou oogênese prejudicada 6,7,8.
As aberrações do cromossomo X podem ser divididas em: 1) aberrações numéricas, nas quais o número de cromossomos X é diferente, mas os cromossomos X estão intactos; e 2) aberrações estruturais, nas quais o cromossomo X ganhou ou perdeu material genético 3,9. As aberrações numéricas do cromossomo X são mais comuns que as anormalidades estruturais e são frequentemente causadas por erros espontâneos durante a divisão celular 3,9. Quando este erro ocorre durante a meiose, pode levar a gametas aneuplóides e, finalmente, a descendentes com aberrações cromossômicas em todas as células. Quando defeitos cromossômicos surgem em células somáticas como resultado de erros que ocorrem durante a mitose nos estágios iniciais da ontogênese, isso pode levar ao mosaicismo. Nesses indivíduos, tanto células com conteúdo cromossômico X normal quanto células com aberrações cromossômicas X estão presentes.
Na década de 1980, uma técnica citogenética chamada hibridização in situ fluorescente (FISH) foi desenvolvida para visualizar e localizar sequências específicas de ácidos nucléicos em cromossomos metafásicos e interfásicos10,11. Essa técnica usa sondas de DNA marcadas com fluorescência para se ligar a uma sequência específica no cromossomo, que pode ser visualizada usando um microscópio de fluorescência.
Atualmente, a FISH é amplamente utilizada como ferramenta diagnóstica clínica e considerada o padrão-ouro na detecção de aberrações cromossômicas10. No campo da medicina reprodutiva, a análise de FISH em espermatozoides tem sido utilizada para obter informações sobre o conteúdo cromossômico X dos espermatozoides em machos com aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais em células somáticas12,13,14. Esses estudos mostraram que homens com aberrações cromossômicas eram mais propensos a ter uma maior frequência de espermatozoides aneuploides presentes em seu sêmen em comparação com homens com cariótipos normais12,13,14.
Em contraste com os espermatozoides, muito pouco se sabe sobre o conteúdo cromossômico X das células ovarianas (incluindo ovócitos, células granulosas/tecais e células estromais) em indivíduos com aberração cromossômica, bem como as possíveis consequências das aneuploidias dessas células sobre seu potencial reprodutivo. Uma razão importante para a escassa informação sobre o cariótipo das células ovarianas em comparação com os espermatozoides é o fato de que as mulheres têm que se submeter a um procedimento invasivo, como uma punção do folículo ou cirurgia para obter ovócitos ou tecido do córtex ovariano. Os gametas femininos são, portanto, de difícil obtenção para fins de pesquisa.
Atualmente, um estudo observacional de intervenção está sendo realizado na Holanda para explorar a eficácia da criopreservação do tecido ovariano em mulheres jovens com ST15. Um fragmento de tecido do córtex ovariano da paciente estava disponível para identificar o conteúdo cromossômico X das células ovarianas16,17. Como parte do estudo, um novo método foi desenvolvido com base em FISH do tecido dissociado do córtex ovariano para determinar se aberrações cromossômicas estão presentes em células ovarianas em fêmeas portadoras de uma aberração cromossômica em células somáticas não ovarianas, como linfócitos ou células bucais. Além disso, o efeito das aneuploidias nas células ovarianas sobre a foliculogênese também foi determinado. Para este fim, um protocolo de FISH estabelecido foi modificado que permite a análise de cortes histológicos do tecido do córtex ovariano após foliculogênese artificialmente induzida durante xenotransplante de longo prazo em camundongos imunocomprometidos. Neste estudo, apresentamos dois métodos baseados em FISH para determinar o conteúdo cromossômico X em células ovarianas em tecido do córtex ovariano não enxertado e enxertado em mulheres com aberrações cromossômicas X, com o objetivo de aprimorar a ciência básica sobre este tema.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Milhões de pessoas em todo o mundo lidam com questões relativas à fertilidade. A redução da fertilidade, ou mesmo a infertilidade, pode ser devida a muitas causas diferentes, incluindo doenças genéticas, das quais as anormalidades cromossômicas são as mais comuns. A hibridação in situ fluorescente (FISH) é um método bem conhecido e frequentemente utilizado para detectar aberrações cromossômicas em humanos. A FISH é usada principalmente para a análise de anormalidades cromossômicas nos espermatozoides de machos com aberrações cromossômicas numéricas ou estruturais. Além disso, essa técnica também é frequentemente aplicada em mulheres para detectar aberrações cromossômicas X que sabidamente causam disgenesia ovariana. No entanto, ainda faltam informações sobre o conteúdo cromossômico X de células ovarianas de mulheres com aberrações cromossômicas X em linfócitos e/ou células bucais.
O objetivo deste estudo é avançar na pesquisa básica sobre aberrações cromossômicas X em fêmeas, apresentando dois métodos baseados em FISH para identificar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas. Primeiro, um método é descrito para determinar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas isoladas (ovócitos, células da granulosa e células estromais) em tecido do córtex ovariano não enxertado de mulheres com aberrações cromossômicas X. O segundo método é direcionado a avaliar o efeito das aberrações cromossômicas na foliculogênese, determinando o conteúdo cromossômico X de células ovarianas de folículos secundários e antrais recém-formados no tecido ovariano, de fêmeas com aberrações cromossômicas X após enxertia de longo prazo em camundongos imunocomprometidos. Ambos os métodos podem ser úteis em pesquisas futuras para obter informações sobre o potencial reprodutivo de fêmeas com aberrações cromossômicas X.

FISH em células ovarianas isoladas antes da enxertia Tecido cortical ovariano criopreservado de fêmeas com ST 45,X/46,XX (paciente A) ou 45,X/46,XX/47,XXX (paciente B) foi utilizado para ilustrar os resultados utilizando este protocolo. No paciente A, 50% dos linfócitos tinham cariótipo 45,X e 50% tinham cariótipo 46,XX. No paciente B, 38% dos linfócitos eram 45,X, 28% 46,XX e 34% 47,XXX. Sondas centrômero-específicas para o cromossomo X (verde) e o cromossomo 18 como controle (vermelho) foram...

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Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Este artigo apresenta dois métodos baseados na hibridização in situ fluorescente para determinar o conteúdo cromossômico X de células ovarianas em tecido córtex ovariano não enxertado e enxertado de fêmeas com aberrações cromossômicas X.

Explorando aberrações cromossômicas X em células ovarianas usando hibridização in situ fluorescente

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

A análise FISH de células ovarianas de fêmeas com aberrações cromossômicas X é uma técnica única para obter informações sobre o conteúdo cromossômico X das células ovarianas neste grupo específico. Essas técnicas podem ser úteis para aprender mais sobre o potencial reprodutivo em fêmeas com aberrações cromossômicas X. É importante mencionar que ambos os métodos têm a intenção de facilitar pesquisas futuras, e não são projetados para serem usados como ferramenta diagnóstica na prática clínica.Quem demonstrará o procedimento serão Ronald Peek, pesquisador sênior do nosso laboratório de fertilidade, e Milad Intezar, analista do nosso departamento de patologia. Para começar, corte o tecido do córtex ovariano criopreservado ou descongelado em pequenos pedaços de um por um milímetro usando um bisturi. Digerir enzimaticamente os fragmentos de tecido em quatro litros de L15 pré-aquecido por 75 minutos a 37 graus Celsius.Pipetar a mistura de digestão para cima e para baixo a cada 15 minutos. Pare a digestão enzimática adicionando quatro mililitros de L15 frio suplementado com 10%Fetal Bovine Serum, ou FBS. Lavar o tecido dissociado uma vez com oito mililitros de meio L15 frio por centrifugação a 500 g antes de ressuspender em 500 microlitros de meio L15.Transfira a suspensão celular contendo em grande parte células estromais individuais e pequenos folículos para uma placa de Petri de plástico e examine a suspensão sob um microscópio estéreo. Pegue os folículos com menos de 50 micrômetros de tamanho manualmente usando uma pipeta plástica de 75 micrômetros e transfira-os para a gota do meio L15 suplementado com 10% FBS a quatro graus Celsius. Em seguida, transfira os folículos purificados para uma solução de 0,06% de tripsina, um miligrama por mililitro de EDTA e um miligrama por mililitro de glicose, e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius.Após a incubação, obter células do estroma ovariano a partir da suspensão de células do córtex usando uma pipeta plástica de 75 micrômetros. Para a Hibridização In Situ por Fluorescência, ou análise FISH de células ovarianas individuais, transfira os folículos ovarianos tratados com tripsina/EDTA/glicose, ou células estromais para gotículas de cinco microlitros de cloreto de potássio 0,15 milimolar e 15 microlitros de DPBS em uma lâmina, e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius. Secar e pré-fixar a lâmina em 300 microlitros de cloreto de potássio 0,05 milimolar, ácido acético a 7,5% e metanol a 22,5% por dois minutos.Cubra a lâmina com ácido acético metanol três a um por dois minutos para finalizar a fixação. Após a fixação, lavar a amostra duas vezes em CCS recém-preparada a 73 graus Celsius. Cubra com 100 microlitros de 2% de Proteinase K e sele com uma lamínula.Incubar a lâmina por 10 minutos a 37 graus Celsius na estação de hibridização. Após a incubação, remova a tampa e lave a lâmina por cinco minutos em DPBS à temperatura ambiente sob agitação. Fixar a amostra por cinco minutos com formol a 1%.Em seguida, lave a lâmina em DPBS e desidrate-a em série em concentrações crescentes de etanol por dois minutos cada. Seque a amostra ao ar antes de hibridizá-la com sondas fluorescentemente marcadas. Em seguida, adicione um microlitro de CEPX, um microlitro de CEP18 e 18 microlitros do tampão de hibridização à amostra e sele com uma tampa que é colada na lâmina.Transfira a lâmina para a estação de hibridização para desnaturação a 73 graus Celsius por três minutos, seguida de hibridização durante uma incubação noturna a 37 graus Celsius. Após a hibridização, remova a tampa e qualquer cola restante da lâmina. Lavar a lâmina em 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 a 72 graus Celsius por dois minutos, seguido de incubação por um minuto em 2X SSC e 0,1% Tween-20.Desidrate a lâmina como demonstrado e seque-a ao ar no escuro antes de cobri-la com um meio de montagem contendo DAPI. Coloque a lâmina a menos 20 graus Celsius por 10 minutos antes da análise por microscopia de fluorescência. Para hibridizar seções de parafina, selecione novas seções antes ou depois da seção que contém folículos da fita de parafina.Monte uma seção em uma lâmina de vidro e seque-a por 45 minutos em um fogão a 56 graus Celsius. Desparafinizar a seção em xileno por 10 minutos, depois imergir a lâmina em etanol 99,5% e enxaguar por cinco minutos em água da torneira. Pré-trate a lâmina com a solução de recuperação do alvo por 10 minutos a 96 graus Celsius.Após esfriar, enxágue a lâmina em água destilada. Trate a lâmina por cinco minutos com ácido clorídrico 0,01 molar, seguido de digestão de pepsina por 15 minutos a 37 graus Celsius. Enxaguar novamente a lâmina em ácido clorídrico e, posteriormente, em PBS.Fixe a lâmina em PBS de formol a 1% durante cinco minutos. Em seguida, enxágue brevemente a lâmina em PBS e novamente em água desmineralizada antes de desidratá-la em etanol 99,5%. Aplicar cinco microlitros de sonda CEP18 e CEPX sobre a lâmina pré-tratada.Em seguida, aplique uma tampa e sele a área com cola fotográfica. Coloque a lâmina em um hibridizador para desnaturação a 80 graus Celsius por 10 minutos e hibridização durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue a lâmina duas vezes por cinco minutos cada em SSC a 42 graus Celsius, seguido por um enxágue de dois minutos e um minuto em 0,3% Nonidet P-40 a 73 graus Celsius.Novamente, enxaguar a lâmina em SSC 2X seguido de enxágue em água destilada antes de desidratá-la com etanol 99,5%. Seque a corrediça ao ar e monte-a em meio de montagem contendo DAPI. O tecido cortical ovariano criopreservado na Paciente A apresentava 50% dos linfócitos, tinha cariótipo X 45 e 50% 46, XX.In Paciente B, 38% dos linfócitos 45, X, 28% 46, XX e 34% 47, XXX.As células estromais adjacentes também foram analisadas para o conteúdo cromossômico X. A digestão enzimática do tecido do córtex ovariano resultou em uma suspensão de células amplamente dissociadas, mas deixando os folículos primordiais, consistindo de um ovócito intacto cercado por uma única camada de células de granulose. Folículos pequenos apresentaram dificuldades na interpretação dos sinais após FISH, devido à aglomeração das células da granulose.A digestão adicional dos folículos com tripsina antes da FISH resultou em células individuais de granulose contraindo em uma morfologia esférica na superfície dos folículos. A coloração pela hematoxilina-eosina mostrou folículos secundários e antrais morfologicamente normais no tecido do córtex ovariano após cinco meses de xenoenxertia. O conteúdo cromossômico X das células de granulose desses folículos foi determinado por análise de FISH.A fixação de tecido do córtex ovariano enxertado em solução de Bouin resultou em sinais fluorescentes borrados e amplamente obscurecidos nas células foliculares devido a uma névoa verde. Em contraste, o tecido do córtex ovariano fixado em formaldeído forneceu excelentes sinais fluorescentes. O principal desafio deste protocolo está no isolamento das células ovarianas e na digestão enzimática do tecido.O desvio desse protocolo pode causar uma perda substancial de células ovarianas durante o processo, e isso deve ser evitado especialmente em mulheres que já têm uma baixa reserva ovariana. Um perfil adicional de expressão gênica pode ser útil para aprender mais sobre o impacto das células ovarianas aneuploides na foliculogênese e, portanto, no processo de falência ovariana prematura em mulheres com aberrações cromossômicas X.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Análise da aberrações cromossômicas induzidas Matéria Ambient Particulate Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

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Detecção de Inter-aberrações cromossômicas estáveis ​​por fluorescência múltipla<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização (mFISH) e Spectral Cariotipagem (SKY) em ratos irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

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Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

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Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...