Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Los autores agradecen a Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef y Milan Intezar por su experiencia y asistencia técnica. Fuentes de financiación: Merck Serono (A16-1395), Goodlife y Ferring.

El protocolo del estudio TurnerFertility ha sido aprobado por el Comité Central de Investigación con Seres Humanos (NL57738.000.16). En este estudio, se obtuvo el tejido de la corteza ovárica de 93 mujeres con ST. Los materiales que requieren precauciones de seguridad se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1: Precauciones de seguridad.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Material</st...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

El análisis FISH es una técnica bien conocida para detectar aberraciones cromosómicas X en linfocitos o células bucales tanto de hombres como de mujeres10. Varios estudios han descrito FISH en gametos de varones con aberraciones cromosómicas X, pero todavía falta información detallada obtenida por FISH en células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X14. Este artículo presenta nuevos métodos basados en FISH para determinar si la aneuploidía está p...

La infertilidad es un problema de salud del sistema reproductor masculino o femenino, que afecta a aproximadamente 186 millones de personas en edad reproductiva en todo el mundo1. En al menos el 35% de las parejas infértiles, la infertilidad es causada por un trastorno del sistema reproductor femenino2. Hay muchos factores que pueden causar infertilidad femenina, como factores genéticos, anomalías del tracto genital, disfunción endocrina, enfermedades inflamatorias y tratamiento iatrogénico3.
Las anomalías genéticas están presentes en aproximadamente 10% de las hembras infértiles 4,5. De todas las anomalías genéticas, las aberraciones del cromosoma X son la causa más común de disgenesia ovárica2. Varios estudios han reportado que las aberraciones cromosómicas X en mujeres con síndrome de Turner (ST) o síndrome Triple X están asociadas con insuficiencia ovárica prematura debido a una pérdida acelerada de células germinales o alteración de la ovogénesis 6,7,8.
Las aberraciones del cromosoma X se pueden dividir en: 1) aberraciones numéricas, en las que el número de cromosomas X es diferente pero los cromosomas X están intactos; y 2) aberraciones estructurales, en las que el cromosoma X ha ganado o perdido material genético 3,9. Las aberraciones numéricas del cromosoma X son más comunes que las anomalías estructurales y a menudo son causadas por errores espontáneos durante la división celular 3,9. Cuando tal error ocurre durante la meiosis, puede conducir a gametos aneuploides y, en última instancia, a descendencia con aberraciones cromosómicas en todas las células. Cuando surgen defectos cromosómicos en las células somáticas como resultado de errores que ocurren durante la mitosis en las primeras etapas de la ontogénesis, puede conducir al mosaicismo. En estos individuos, tanto las células con contenido cromosómico X normal como las células con aberraciones cromosómicas X están presentes.
En la década de 1980, se desarrolló una técnica citogenética llamada hibridación fluorescente in situ (FISH) para visualizar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en los cromosomas de metafase e interfase10,11. Esta técnica utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para unirse a una secuencia específica en el cromosoma, que luego se puede visualizar mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.
Hoy en día, el FISH es ampliamente utilizado como herramienta de diagnóstico clínico y es considerado el estándar de oro en la detección de aberraciones cromosómicas10. En el campo de la medicina reproductiva, el análisis FISH en espermatozoides se ha utilizado para obtener información sobre el contenido cromosómico X de los espermatozoides en varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales en células somáticas12,13,14. Estos estudios mostraron que los varones con aberraciones cromosómicas tenían más probabilidades de tener una mayor frecuencia de espermatozoides aneuploides presentes en su semen en comparación con los hombres con cariotipos normales12,13,14.
A diferencia de los espermatozoides, se sabe muy poco sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas (incluidos los ovocitos, las células granulosa/teca y las células del estroma) en individuos con una aberración cromosómica, así como las posibles consecuencias de la aneuploidía de estas células en su potencial reproductivo. Una razón importante para la escasa información sobre el cariotipo de las células ováricas en comparación con los espermatozoides es el hecho de que las mujeres tienen que someterse a un procedimiento invasivo como una punción del folículo o una cirugía para obtener ovocitos o tejido de la corteza ovárica. Los gametos femeninos son, por lo tanto, difíciles de obtener con fines de investigación.
Actualmente, se está realizando un estudio de intervención observacional en los Países Bajos para explorar la eficacia de la criopreservación del tejido ovárico en mujeres jóvenes con ST15. Un fragmento del tejido de la corteza ovárica de la paciente estaba disponible para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas16,17. Como parte del estudio, se desarrolló un nuevo método basado en FISH de tejido de corteza ovárica disociado para determinar si las aberraciones cromosómicas están presentes en las células ováricas en mujeres portadoras de una aberración cromosómica en células somáticas no ováricas, como linfocitos o células bucales. Además, también se determinó el efecto de la aneuploidía en las células ováricas sobre la foliculogénesis. Con este fin, se modificó un protocolo FISH establecido que permite el análisis de secciones histológicas de tejido de la corteza ovárica después de la foliculogénesis inducida artificialmente durante el xenotrasplante a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. En este estudio, presentamos dos métodos basados en FISH para determinar el contenido cromosómico X en células ováricas en tejido de corteza ovárica no injertado e injertado en mujeres con aberraciones cromosómicas X, con el objetivo de mejorar la ciencia básica sobre este tema.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Millones de personas en todo el mundo se ocupan de cuestiones relacionadas con la fertilidad. La reducción de la fertilidad, o incluso la infertilidad, puede deberse a muchas causas diferentes, incluidos los trastornos genéticos, de los cuales las anomalías cromosómicas son las más comunes. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método bien conocido y utilizado con frecuencia para detectar aberraciones cromosómicas en humanos. FISH se utiliza principalmente para el análisis de anomalías cromosómicas en los espermatozoides de varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales. Además, esta técnica también se aplica con frecuencia en mujeres para detectar aberraciones cromosómicas X que se sabe que causan disgenesia ovárica. Sin embargo, todavía falta información sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X en linfocitos y/o células bucales.
El objetivo de este estudio es avanzar en la investigación básica sobre las aberraciones cromosómicas X en mujeres, mediante la presentación de dos métodos basados en FISH para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas. Primero, se describe un método para determinar el contenido cromosómico X de células ováricas aisladas (ovocitos, células de la granulosa y células del estroma) en tejido de corteza ovárica no injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X. El segundo método está dirigido a evaluar el efecto de las aberraciones cromosómicas en la foliculogénesis mediante la determinación del contenido cromosómico X de las células ováricas de los folículos secundarios y antrales recién formados en el tejido ovárico, de hembras con aberraciones cromosómicas X después de un injerto a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. Ambos métodos podrían ser útiles en futuras investigaciones para obtener información sobre el potencial reproductivo de las mujeres con aberraciones cromosómicas X.

FISH en células ováricas aisladas antes del injerto Se utilizó tejido criopreservado de la corteza ovárica de mujeres con TS 45,X/46,XX (paciente A) o 45,X/46,XX/47,XXX (paciente B) para ilustrar los resultados utilizando este protocolo. En el paciente A, el 50% de los linfocitos tenían un cariotipo 45,X y el 50% tenían 46,XX. En el paciente B, el 38% de los linfocitos fueron 45,X, el 28% 46,XX y el 34% 47,XXX. Se utilizaron sondas específicas del centrómero para el cromosoma X (verde) y el cr...

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Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Este artículo presenta dos métodos basados en la hibridación fluorescente in situ para determinar el contenido cromosómico X de las células ováricas en tejido de la corteza ovárica no injertado e injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X.

Exploración de las aberraciones cromosómicas X en células ováricas mediante el uso de hibridación fluorescente in situ

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

El análisis FISH de células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X es una técnica única para obtener información sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas en este grupo específico. Estas técnicas podrían ser útiles para aprender más sobre el potencial reproductivo en mujeres con aberraciones cromosómicas X. Es importante mencionar que ambos métodos están destinados a facilitar futuras investigaciones, y no están diseñados para ser utilizados como una herramienta de diagnóstico en la práctica clínica.Demostrando el procedimiento estarán Ronald Peek, investigador principal de nuestro laboratorio de fertilidad, y Milad Intezar, analista de nuestro departamento de patología. Para comenzar, corte el tejido de la corteza ovárica criopreservado o descongelado en trozos pequeños de uno por uno por milímetro con un bisturí. Digiere enzimáticamente los fragmentos de tejido en cuatro litros de L15 precalentado durante 75 minutos a 37 grados centígrados.Pipetear la mezcla de digestión hacia arriba y hacia abajo cada 15 minutos. Detenga la digestión enzimática agregando cuatro mililitros de L15 frío suplementado con 10% de suero bovino fetal, o FBS. Lavar el tejido disociado una vez con ocho mililitros de medio L15 frío por centrifugación a 500 g antes de volver a suspender en 500 microlitros de medio L15.Transfiera la suspensión celular que contiene células estromales en gran parte individuales y folículos pequeños a una placa de Petri de plástico, y examine la suspensión bajo un microscopio estéreo. Elija manualmente los folículos de menos de 50 micrómetros de tamaño utilizando una pipeta de plástico de 75 micrómetros y transfiéralos a la gota de medio L15 suplementada con 10% FBS a cuatro grados centígrados. Luego transfiera los folículos purificados a una solución de 0.06% de tripsina, un miligramo por mililitro EDTA y un miligramo por mililitro de glucosa, e incube durante 20 minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación, obtenga células del estroma ovárico de la suspensión celular de la corteza utilizando una pipeta de plástico de 75 micrómetros. Para la hibridación fluorescente in situ, o análisis FISH de células ováricas individuales, transfiera los folículos ováricos tratados con tripsina / EDTA / glucosa, o células estromales a gotitas de cinco microlitros de cloruro de potasio milimolar de 0.15 y 15 microlitros de DPBS en un portaobjetos, e incubar durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Seque y fije previamente el portaobjetos en 300 microlitros de cloruro de potasio milimolar 0.05, ácido acético al 7.5% y metanol al 22.5% durante dos minutos.Cubra el portaobjetos con ácido acético metanol de tres a uno durante dos minutos para finalizar la fijación. Después de la fijación, lave la muestra dos veces en SSC recién preparado a 73 grados centígrados. Cúbralo con 100 microlitros de 2% de proteinasa K y séllelo con un cubreobjetos.Incubar el tobogán durante 10 minutos a 37 grados centígrados en la estación de hibridación. Después de la incubación, retire el cubreobjetos y lave el portaobjetos durante cinco minutos en DPBS a temperatura ambiente bajo agitación. Fijar la muestra durante cinco minutos con formaldehído al 1%.Luego lave el portaobjetos en DPBS y deshidrate en serie en concentraciones crecientes de etanol durante dos minutos cada uno. Seque al aire la muestra antes de hibridarla con sondas marcadas con fluorescencia. A continuación, agregue un microlitro de CEPX, un microlitro de CEP18 y 18 microlitros del tampón de hibridación a la muestra y selle con un cubreobjetos que esté pegado al portaobjetos.Transfiera el portaobjetos a la estación de hibridación para su desnaturalización a 73 grados centígrados durante tres minutos, seguido de la hibridación durante una incubación nocturna a 37 grados centígrados. Después de la hibridación, retire el deslizamiento de la cubierta y cualquier pegamento restante de la diapositiva. Lave el portaobjetos en 0.4X SSC, 0.3% Tween-20 a 72 grados Celsius durante dos minutos, seguido de incubación durante un minuto en 2X SSC y 0.1% Tween-20.Deshidrate el portaobjetos como se muestra y séquelo al aire en la oscuridad antes de cubrirlo con un medio de montaje que contenga DAPI. Coloque el portaobjetos a menos 20 grados centígrados durante 10 minutos antes del análisis por microscopía de fluorescencia. Para hibridar secciones de parafina, seleccione nuevas secciones antes o después de la sección que contiene folículos de la cinta de parafina.Monte una sección en un tobogán de vidrio y séquelo durante 45 minutos en una estufa a 56 grados centígrados. Desparafinar la sección en xileno durante 10 minutos, luego sumergir el portaobjetos en etanol al 99,5% y enjuagarlo durante cinco minutos en agua del grifo. Pretrate el portaobjetos con la solución de recuperación del objetivo durante 10 minutos a 96 grados centígrados.Después de enfriar, enjuague el tobogán con agua destilada. Trate el portaobjetos durante cinco minutos con ácido clorhídrico molar 0.01, seguido de digestión de pepsina durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Enjuague el portaobjetos nuevamente en ácido clorhídrico y posteriormente en PBS.Fije la diapositiva en PBS de formaldehído al 1% durante cinco minutos. Luego enjuague brevemente el portaobjetos en PBS, y nuevamente en agua desmineralizada antes de deshidratarlo en etanol al 99.5%. Aplique cinco microlitros de sonda CEP18 y CEPX en el portaobjetos pretratado.Luego aplique un cubreobjetos y selle el área con pegamento fotográfico. Coloque el portaobjetos en un hibridador para la desnaturalización a 80 grados centígrados durante 10 minutos y la hibridación durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague el portaobjetos dos veces durante cinco minutos cada una en SSC a 42 grados centígrados, seguido de un enjuague de dos minutos y un minuto en Nonidet P-40 al 0,3% a 73 grados centígrados.Nuevamente, enjuague el portaobjetos en 2X SSC seguido de enjuague con agua destilada antes de deshidratarlo con etanol al 99.5%. Seque al aire la corredera y móntela en un medio de montaje que contenga DAPI. El tejido de la corteza ovárica criopreservada en el paciente A mostró que el 50% de los linfocitos tenía un cariotipo 45, X y el 50% tenía 46, XX.In el paciente B, el 38% de los linfocitos eran 45, X, el 28% eran 46, XX, y el 34% eran 47, XXX.Las células estromales circundantes también se analizaron para determinar el contenido del cromosoma X. La digestión enzimática del tejido de la corteza ovárica resultó en una suspensión de células en gran parte disociadas, pero dejando los folículos primordiales, que consisten en un ovocito intacto rodeado por una sola capa de células de granulosis. Los folículos pequeños proporcionaron dificultades para interpretar las señales después de FISH, debido a la aglutinación de las células de granulosis.La digestión adicional de los folículos con tripsina antes de FISH dio como resultado que las células de granulosis individuales se contrajeran en una morfología esférica en la superficie de los folículos. La tinción con hematoxilina con eosina mostró folículos secundarios y antrales morfológicamente normales en el tejido de la corteza ovárica después de cinco meses de xenoinjerto. El contenido cromosómico X de las células de granulosis de estos folículos se determinó mediante análisis FISH.La fijación del tejido de la corteza ovárica injertada en la solución de Bouin dio lugar a señales fluorescentes borrosas y en gran parte oscurecidas en las células foliculares debido a una neblina verde. En contraste, el tejido de la corteza ovárica fijado en formaldehído proporcionó excelentes señales fluorescentes. El principal reto de este protocolo radica en el aislamiento de las células ováricas y la digestión enzimática del tejido.Desviarse de este protocolo puede causar una pérdida sustancial de células ováricas durante el proceso, y esto debe evitarse especialmente en mujeres que ya tienen una reserva ovárica baja. El perfil adicional de la expresión génica podría ser útil para aprender más sobre el impacto de las células ováricas aneuploides en la foliculogénesis y, por lo tanto, el proceso de insuficiencia ovárica prematura en mujeres con aberraciones cromosómicas X.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

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In Situ marcaje de ADN mitocondrial de replicación en Drosophila ovarios adultos por Edu tinción

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Investigación

Genética

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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Optogenética aleatoria de mutagénesis, utilizando la histona-miniSOG en<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

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El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

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La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

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Visualización de la Microbiota en agallas de garrapata por Whole-mount In Situ hibridación

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

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Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

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Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

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MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...