Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Författarna erkänner Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef och Milan Intezar för deras expertis och tekniska hjälp. Finansieringskällor: Merck Serono (A16-1395), Goodlife och Ferring.

TurnerFertility-studieprotokollet har godkänts av Central Committee on Research Involving Human Subjects (NL57738.000.16). I denna studie erhölls äggstocksbarkvävnaden hos 93 honor med TS. Material som kräver säkerhetsåtgärder anges i tabell 1.
Tabell 1: Säkerhetsåtgärder.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Material</td>
			<td colspan="3">Fara</strong...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

FISH-analys är en välkänd teknik för att detektera X-kromosomavvikelser i lymfocyter eller buckala celler hos både män och kvinnor10. Flera studier har beskrivit FISH på könsceller hos hanar med X-kromosomavvikelser, men detaljerad information som erhållits av FISH på äggstocksceller från honor med X-kromosomavvikelser saknas fortfarande14. Denna artikel presenterar nya metoder baserade på FISH för att avgöra om aneuploidi är närvarande i äggstockscellerna...

Infertilitet är en hälsofråga i det manliga eller kvinnliga reproduktionssystemet och påverkar cirka 186 miljoner individer i reproduktiv ålder över hela världen1. I minst 35% av infertila par orsakas infertilitet av en störning i det kvinnliga reproduktionssystemet2. Det finns många faktorer som kan orsaka kvinnlig infertilitet, såsom genetiska faktorer, könsorgansavvikelser, endokrin dysfunktion, inflammatoriska sjukdomar och iatrogen behandling3.
Genetiska avvikelser förekommer hos cirka 10% av infertila kvinnor 4,5. Av alla genetiska avvikelser är X-kromosomavvikelser den vanligaste orsaken till äggstocksdysgenes2. Flera studier har rapporterat att X-kromosomavvikelser hos kvinnor med Turners syndrom (TS) eller Triple X-syndrom är associerade med för tidig äggstockssvikt på grund av en accelererad förlust av könsceller eller nedsatt oogenes 6,7,8.
Aberrationer av X-kromosomen kan delas in i: 1) numeriska avvikelser, där antalet X-kromosomer är olika men X-kromosomerna är intakta; och 2) strukturella avvikelser, där X-kromosomen har fått eller förlorat genetiskt material 3,9. Numeriska avvikelser i X-kromosomen är vanligare än strukturella avvikelser och orsakas ofta av spontana fel under celldelning 3,9. När ett sådant fel inträffar under meios kan det leda till aneuploida gameter och slutligen till avkomma med kromosomavvikelser i alla celler. När kromosomdefekter uppstår i somatiska celler som ett resultat av fel som uppstår under mitos i de tidiga stadierna av ontogenes kan det leda till mosaicism. Hos dessa individer finns både celler med normalt X-kromosomalt innehåll och celler med X-kromosomavvikelser.
På 1980-talet utvecklades en cytogenetisk teknik som kallas fluorescens in situ hybridisering (FISH) för att visualisera och lokalisera specifika nukleinsyrasekvenser på metafas- och interfaskromosomer10,11. Denna teknik använder fluorescerande märkta DNA-sonder för att binda till en specifik sekvens i kromosomen, som sedan kan visualiseras med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
Numera används FISH i stor utsträckning som ett kliniskt diagnostiskt verktyg och anses vara guldstandarden för att upptäcka kromosomavvikelser10. Inom reproduktionsmedicin har FISH-analys på spermier använts för att få insikt i X-kromosominnehållet i spermier hos män med numeriska eller strukturella kromosomavvikelser i somatiska celler12,13,14. Dessa studier visade att män med kromosomavvikelser var mer benägna att ha en högre frekvens av aneuploida spermier närvarande i sin sperma jämfört med män med normala karyotyper12,13,14.
I motsats till spermier är mycket lite känt om X-kromosominnehållet i äggstocksceller (inklusive oocyter, granulosa/theca-celler och stromaceller) hos individer med kromosomavvikelse, liksom de möjliga konsekvenserna av aneuploidi hos dessa celler på deras reproduktionspotential. En viktig orsak till den knappa informationen om karyotypen av äggstocksceller jämfört med spermatozoa är det faktum att kvinnor måste genomgå ett invasivt förfarande som follikelpunktion eller operation för att erhålla oocyter eller äggstocksbarkvävnad. Kvinnliga könsceller är därför svåra att få tag på för forskningsändamål.
För närvarande utförs en observationsinterventionsstudie i Nederländerna för att undersöka effekten av kryokonservering av äggstocksvävnad hos unga kvinnor med TS15. Ett fragment av patientens äggstocksbarkvävnad var tillgängligt för att identifiera X-kromosominnehållet i äggstockscellerna16,17. Som en del av studien utvecklades en ny metod baserad på FISH av dissocierad äggstockscortexvävnad för att avgöra om kromosomavvikelser finns i äggstocksceller hos kvinnor som bär en kromosomavvikelse i icke-äggstockssomatiska celler, såsom lymfocyter eller buckala celler. Dessutom bestämdes effekten av aneuploidi i äggstocksceller på follikulogenes. För detta ändamål modifierades ett etablerat FISH-protokoll som möjliggör analys av histologiska sektioner av äggstocksbarkvävnad efter artificiellt inducerad follikulogenes under långvarig xenotransplantation hos immunsupprimerade möss. I denna studie presenterar vi två metoder baserade på FISH för att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller i icke-ympad och ympad äggstocksbarkvävnad hos kvinnor med X-kromosomavvikelser, i syfte att förbättra grundvetenskapen om detta ämne.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Miljontals människor världen över hanterar frågor som rör fertilitet. Minskad fertilitet, eller till och med infertilitet, kan bero på många olika orsaker, inklusive genetiska störningar, varav kromosomavvikelser är de vanligaste. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) är en välkänd och ofta använd metod för att upptäcka kromosomavvikelser hos människor. FISH används huvudsakligen för analys av kromosomavvikelser i spermier hos män med numeriska eller strukturella kromosomavvikelser. Dessutom används denna teknik också ofta hos kvinnor för att upptäcka X-kromosomavvikelser som är kända för att orsaka äggstocksdysgenes. Information om X-kromosominnehållet i äggstocksceller från kvinnor med X-kromosomavvikelser i lymfocyter och/eller buckala celler saknas dock fortfarande.
Syftet med denna studie är att främja grundforskning om X-kromosomavvikelser hos kvinnor, genom att presentera två metoder baserade på FISH för att identifiera X-kromosominnehållet i äggstocksceller. Först beskrivs en metod för att bestämma X-kromosominnehållet i isolerade äggstocksceller (oocyter, granulosaceller och stromaceller) i icke-ympad äggstockscortexvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser. Den andra metoden är inriktad på att utvärdera effekten av kromosomavvikelser på follikulogenes genom att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller i nybildade sekundära och antrala folliklar i äggstocksvävnad, från kvinnor med X-kromosomavvikelser efter långvarig ympning i immunsupprimerade möss. Båda metoderna kan vara till hjälp i framtida forskning för att få insikt i reproduktionspotentialen hos kvinnor med X-kromosomavvikelser.

FISK på isolerade äggstocksceller före ympning Kryokonserverad vävnad från äggstockarna från kvinnor med 45,X/46,XX (patient A) eller 45,X/46,XX/47,XXX (patient B) TS användes för att illustrera resultaten med hjälp av detta protokoll. Hos patient A hade 50 % av lymfocyterna en karyotyp på 45,X och 50 % hade 46,XX. Hos patient B var 38 % av lymfocyterna 45,X, 28 % 46,XX och 34 % 47,XXX. Centromerspecifika sonder för kromosom X (grön) och kromosom 18 som kontroll (röd) användes för att ...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Denna artikel presenterar två metoder baserade på fluorescens in situ hybridisering för att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller i icke-ympad och ympad äggstockscortexvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser.

Utforska X kromosomavvikelser i äggstocksceller genom att använda fluorescens in situ hybridisering

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

FISH-analys av äggstocksceller från kvinnor med X-kromosomavvikelser är en unik teknik för att få insikt i X-kromosominnehållet i äggstocksceller i denna specifika grupp. Dessa tekniker kan vara till hjälp för att lära sig mer om reproduktionspotential hos kvinnor med X-kromosomavvikelser. Det är viktigt att nämna att båda metoderna är avsedda att underlätta framtida forskning och inte är utformade för att användas som ett diagnostiskt verktyg i klinisk praxis.Ronald Peek, seniorforskare från vårt fertilitetslaboratorium, och Milad Intezar, analytiker från vår patologiavdelning, demonstrerar proceduren. För att börja, skära den kryokonserverade eller tinade äggstockscortexvävnaden i små bitar av en efter en efter en millimeter med en skalpell. Enzymatiskt smälta vävnadsfragmenten i fyra liter förvärmd L15 i 75 minuter vid 37 grader Celsius.Pipettera digestionsblandningen upp och ner var 15: e minut. Stoppa den enzymatiska matsmältningen genom att tillsätta fyra milliliter kall L15 kompletterad med 10% Fetal Bovine Serum, eller FBS. Tvätta den dissocierade vävnaden en gång med åtta milliliter kallt L15-medium genom centrifugering vid 500 g innan den återsuspenderas i 500 mikroliter L15-medium.Överför cellsuspensionen som huvudsakligen innehåller enskilda stromaceller och små folliklar till en petriskål av plast och undersök suspensionen under ett stereomikroskop. Plocka folliklarna mindre än 50 mikrometer i storlek manuellt med en 75 mikrometer plastpipett och överför dem till droppen av L15-medium kompletterat med 10% FBS vid fyra grader Celsius. Överför sedan de renade folliklarna till en lösning av 0,06% trypsin, ett milligram per milliliter EDTA och ett milligram per milliliter glukos och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius.Efter inkubation, erhålla äggstocksstromaceller från cortexcellsuspensionen med användning av en 75 mikrometer plastpipett. För fluorescens in situ-hybridisering, eller FISH-analys av enskilda äggstocksceller, överför de behandlade äggstocksfolliklarna med trypsin / EDTA / glukos eller stromaceller till droppar av fem mikroliter 0,15 millimolär kaliumklorid och 15 mikroliter DPBS på ett objektglas och inkubera i 20 minuter vid 37 grader Celsius. Torka och förfixera glaset i 300 mikroliter 0,05 millimolär kaliumklorid, 7,5% ättiksyra och 22,5% metanol i två minuter.Täck glaset med tre-till-en metanolättiksyra i två minuter för att slutföra fixeringen. Efter fixering, tvätta provet två gånger i nyberedd SSC vid 73 grader Celsius. Täck den med 100 mikroliter 2% proteinas K och försegla den med en täckslip.Inkubera glaset i 10 minuter vid 37 grader Celsius i hybridiseringsstationen. Efter inkubation, ta bort lockslipen och tvätta glaset i fem minuter i DPBS vid rumstemperatur under skakning. Fixa provet i fem minuter med 1% formaldehyd.Tvätta sedan glaset i DPBS och torka det i serie i ökande etanolkoncentrationer i två minuter vardera. Lufttorka provet innan det hybridiseras med fluorescerande märkta sonder. Tillsätt sedan en mikroliter CEPX, en mikroliter CEP18 och 18 mikroliter hybridiseringsbuffert till provet och försegla med en täckslip som är limmad på glaset.Överför glaset till hybridiseringsstationen för denaturering vid 73 grader Celsius i tre minuter, följt av hybridisering under en inkubation över natten vid 37 grader Celsius. Efter hybridisering, ta bort lockslipen och eventuellt kvarvarande lim från glaset. Tvätta glaset i 0,4X SSC, 0,3% Tween-20 vid 72 grader Celsius i två minuter, följt av inkubation i en minut i 2X SSC och 0,1% Tween-20.Torka ut glaset enligt bilden och lufttorka det i mörkret innan du täcker det med ett monteringsmedium som innehåller DAPI. Placera glaset på minus 20 grader Celsius i 10 minuter före analys med fluorescensmikroskopi. För att hybridisera paraffinsektioner, välj nya sektioner före eller efter avsnittet som innehåller folliklar från paraffinbandet.Montera en sektion på en glasskiva och torka den i 45 minuter på en spis vid 56 grader Celsius. Avparaffinisera sektionen i xylen i 10 minuter, sänk sedan ner bilden i 99,5% etanol och skölj den i fem minuter i kranvatten. Förbehandla glaset med målhämtningslösningen i 10 minuter vid 96 grader Celsius.Efter kylning, skölj bilden i destillerat vatten. Behandla bilden i fem minuter med 0,01 molar saltsyra, följt av pepsinsmältning i 15 minuter vid 37 grader Celsius. Skölj glaset igen i saltsyra och därefter i PBS.Fixa bilden i 1% formaldehyd PBS i fem minuter. Skölj sedan glaset kort i PBS och igen i demineraliserat vatten innan du torkar ut det i 99,5% etanol. Applicera fem mikroliter sond CEP18 och CEPX på det förbehandlade glaset.Applicera sedan en täckslip och försegla området med fotolim. Placera glaset i en hybridiserare för denaturering vid 80 grader Celsius i 10 minuter och hybridisering över natten vid 37 grader Celsius. Nästa dag, skölj glaset två gånger i fem minuter vardera i SSC vid 42 grader Celsius, följt av en två minuter och en minut skölj i 0,3% Nonidet P-40 vid 73 grader Celsius.Skölj igen glaset i 2X SSC följt av sköljning i destillerat vatten innan du torkar ut det med 99,5% etanol. Lufttorka glaset och montera det i DAPI-innehållande monteringsmedium. Kryokonserverad vävnad i äggstocksbarken hos patient A visade 50% av lymfocyterna, hade en 45, X-karyotyp och 50% hade 46, XX.In patient B var 38% av lymfocyterna 45, X, 28% var 46, XX och 34% var 47, XXX.Omgivande stromaceller analyserades också för X-kromosominnehåll. Enzymatisk nedbrytning av vävnad i äggstocksbarken resulterade i en suspension av i stort sett dissocierade celler, men lämnade de primordiala folliklarna, bestående av en intakt oocyt omgiven av ett enda lager granulosceller. Små folliklar gav svårigheter att tolka signaler efter FISH, på grund av klumpning av granuloscellerna.Ytterligare matsmältning av folliklarna med trypsin före FISH resulterade i att enskilda granulosceller drog ihop sig till en sfärisk morfologi på folliklarnas yta. Hematoxylin eosinfärgning visade morfologiskt normala sekundära och antrala folliklar i äggstocksbarkvävnad efter fem månaders xenografting. X-kromosominnehållet i granulosceller i dessa folliklar bestämdes genom FISH-analys.Fixering av ympad vävnad från äggstocksbarken i Bouin-lösning resulterade i suddiga och till stor del dolda fluorescerande signaler i follikulära celler på grund av en grön dis. Däremot gav äggstocksbarkvävnad fixerad i formaldehyd utmärkta fluorescerande signaler. Den största utmaningen med detta protokoll ligger i isoleringen av äggstocksceller och den enzymatiska nedbrytningen av vävnaden.Att avvika från detta protokoll kan orsaka en betydande förlust av äggstocksceller under processen, och detta bör särskilt undvikas hos kvinnor som redan har en låg äggstocksreserv. Ytterligare genuttrycksprofilering kan vara till hjälp för att lära sig mer om effekterna av aneuploida äggstocksceller på follikulogenes, och därmed processen med för tidigt ovariefel hos kvinnor med X-kromosomavvikelser.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Märkning av mitokondrie-DNA-replikering i Drosophila vuxen Äggstockar från edu färgning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analys av omgivnings Partiklar-inducerad kromosomavvikelser Använda en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Upptäckt av Inter-kromosomala Stabila Aberrations av flera Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (mFISH) och Spectral karyotypering (SKY) i bestrålade möss

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Vävnadsspecifika miRNA uttryck profilering i mus hjärtat sektioner med In Situ -hybridisering

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...