Name: exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Yazarlar Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef ve Milan Intezar'a uzmanlıkları ve teknik yardımları için teşekkür eder. Finansman kaynakları: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ve Ferring.

TurnerFertility çalışma protokolü, İnsan Denekleri İçeren Araştırma Merkez Komitesi (NL57738.000.16) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada TS'li 93 kadının yumurtalık korteks dokusu elde edilmiştir. Güvenlik önlemleri gerektiren malzemeler Tablo 1'de listelenmiştir.
Tablo 1: Güvenlik önlemleri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Malzeme</td>
			...

<ol>
	<li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+and+infertility:+Definition+and+epidemiology.">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li><li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+human+female+infertility.">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li><li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility,+testing,+and+management:+a+narrative+review.">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).</li><li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples.">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li><li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility.">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).</li><li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45,X+karyotype.">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li><li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+X+syndrome:+a+review+of+the+literature.">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li><li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads.">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+err+(meiotically)+is+human:+the+genesis+of+human+aneuploidy.">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li><li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+History,+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH):+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine.">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).</li><li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility.">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li><li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm:+diagnostics,+indications,+and+therapeutic+implications.">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li><li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients:+a+systematic+review+of+the+literature.">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li><li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurnerFertility+trial:+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome.">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).</li><li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner's+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45,X+granulosa+cells.">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li><li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+some+patients+with+45,X+Turner+syndrome+fertile?+A+young+girl+with+classical+45,X+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary.">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li><li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe.">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li><li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice:+comparison+between+four+grafting+sites.">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li><li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+damage+after+grafting:+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes.">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li><li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance.">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li><li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis.">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li></ol>

FISH analizi, hem erkek hem de kadınların lenfositlerinde veya bukkal hücrelerinde X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için iyi bilinen bir tekniktir10. Birçok çalışma, X kromozomal anormallikleri olan erkeklerin gametleri üzerinde FISH'i tanımlamıştır, ancak FISH tarafından X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücreleri hakkında elde edilen ayrıntılı bilgiler hala14'ten yoksundur. Bu makalede, X kromozomal anormallikleri olan ...

Kısırlık, erkek veya kadın üreme sisteminin bir sağlık sorunudur ve dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 186 milyon bireyi etkilemektedir1. İnfertil çiftlerin en az% 35'inde infertilite, kadın üreme sisteminin bir bozukluğundan kaynaklanır2. Kadın infertilitesine neden olabilecek genetik faktörler, genital sistem anormallikleri, endokrin disfonksiyon, inflamatuar hastalıklar ve iyatrojenik tedavi gibi birçok faktör vardır3.
İnfertil kadınların yaklaşık %10'unda genetik anormallikler mevcuttur 4,5. Tüm genetik anormallikler arasında, X kromozomu anormallikleri yumurtalık disgenezisinin en yaygın nedenidir2. Birçok çalışma, Turner sendromu (TS) veya Triple X sendromlu kadınlarda X kromozomal anormalliklerinin, germ hücrelerinin hızlandırılmış kaybı veya bozulmuş oogenez 6,7,8 nedeniyle erken yumurtalık yetmezliği ile ilişkili olduğunu bildirmiştir.
X kromozomunun anormallikleri ayrılabilir: 1) X kromozomlarının sayısının farklı olduğu ancak X kromozomlarının sağlam olduğu sayısal sapmalar; ve 2) X kromozomunun genetik materyal kazandığı veya kaybettiği yapısal sapmalar 3,9. X kromozomunun sayısal anormallikleri yapısal anormalliklerden daha yaygındır ve genellikle hücre bölünmesi sırasındaki kendiliğinden hatalardan kaynaklanır 3,9. Mayoz sırasında böyle bir hata meydana geldiğinde, anöploid gametlere ve nihayetinde tüm hücrelerde kromozomal anormallikleri olan yavrulara yol açabilir. Ontogenezin erken evrelerinde mitoz sırasında meydana gelen hataların bir sonucu olarak somatik hücrelerde kromozom kusurları ortaya çıktığında, mozaikliğe yol açabilir. Bu bireylerde hem normal X kromozomal içeriğine sahip hücreler hem de X kromozomal anormalliklerine sahip hücreler mevcuttur.
1980'lerde, metafaz ve interfaz kromozomları10,11 üzerindeki spesifik nükleik asit dizilerini görselleştirmek ve bulmak için floresan in situ hibridizasyon (FISH) adı verilen sitogenetik bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, kromozomdaki belirli bir diziye bağlanmak için floresan etiketli DNA problarını kullanır ve daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.
Günümüzde, FISH klinik bir tanı aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve kromozomal anormalliklerin saptanmasında altın standart olarak kabul edilmektedir10. Üreme tıbbı alanında, sperm üzerindeki FISH analizi, somatik hücrelerde sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerde spermatozoanın X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır12,13,14. Bu çalışmalar, kromozomal anormallikleri olan erkeklerin, normal karyotipli erkeklere kıyasla menilerinde bulunan anöploid spermatozoa sıklığının daha yüksek olduğunu göstermiştir 12,13,14.
Spermatozoanın aksine, kromozomal anormalliği olan bireylerde yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza / teka hücreleri ve stromal hücreler dahil) X kromozomal içeriği ve bu hücrelerin anöploidisinin üreme potansiyelleri üzerindeki olası sonuçları hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık hücrelerinin karyotipi hakkında spermatozoaya kıyasla az bilgi bulunmasının önemli bir nedeni, kadınların oosit veya yumurtalık korteks dokusu elde etmek için folikül delinmesi veya ameliyatı gibi invaziv bir prosedürden geçmek zorunda kalmalarıdır. Bu nedenle dişi gametlerin araştırma amacıyla elde edilmesi zordur.
Şu anda, Hollanda'da TS15'li genç kadınlarda yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonunun etkinliğini araştırmak için gözlemsel bir müdahale çalışması yapılmaktadır. Hastanın over korteks dokusunun bir parçası, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için mevcuttu16,17. Çalışmanın bir parçası olarak, lenfositler veya bukkal hücreler gibi yumurtalık dışı somatik hücrelerde kromozomal anormallik taşıyan kadınlarda yumurtalık hücrelerinde kromozomal anormalliklerin olup olmadığını belirlemek için ayrışmış yumurtalık korteks dokusunun FISH'ine dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Ayrıca yumurtalık hücrelerinde anöploidinin folikülogenez üzerine etkisi de belirlenmiştir. Bu amaçla, immün sistemi baskılanmış farelerde uzun süreli ksenotransplantasyon sırasında yapay olarak indüklenen folikülogenez sonrası yumurtalık korteks dokusunun histolojik kesitlerinin analizini sağlayan yerleşik bir FISH protokolü değiştirilmiştir. Bu çalışmada, X kromozomal anomalileri olan kadınlarda aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki yumurtalık hücrelerinde X kromozomal içeriğini belirlemek için FISH'e dayalı iki yöntem sunulmuş ve bu konudaki temel bilimi geliştirmek amaçlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Biosolve BV</td>
			<td>0001070602BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 1200</td>
			<td>Hettich Universal</td>
			<td>4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>131470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0631-0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-513Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin-Y</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159350100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>EMSURE</td>
			<td>1009832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>10100147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope for sections DM4 B</td>
			<td>Leica Microsystems&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope scope A1</td>
			<td>Zeiss AXIO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for dissociated cells</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEPX (DXZ1) 05J1023 
			CEP18 (D18Z1) 05J0818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent labeled probes for tissue sections</td>
			<td>Abbott Diagnostics</td>
			<td>CEP X (DXZ1 05J08-023 
			CEP 18 (D18Z1)&#160; 05J10-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue (Fixogum)</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LK071A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1159380025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization buffer</td>
			<td>Abott Diagnostics</td>
			<td>32-804826/06J67-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Station&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1003171000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software on paraffine sections&#160;</td>
			<td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunohitochemistry microscope slides</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K802021-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-700Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase DH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05 401 151 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Zeiss West Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A335586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14262-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vectashield, Vector</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7385-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Poth Hile</td>
			<td>2712.20.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7000-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-4075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation microtome HM 355S</td>
			<td>Thermo sceintific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Dahlhausen</td>
			<td>11.000.00.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide for FISH on dissociated cells</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1810AM1JZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>55761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Sodium Citrate (SSC)</td>
			<td>Fisher Scientific, Invitrogen</td>
			<td>10515203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope IX 70</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target Retrieval Solution &#160;&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>GV80511-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>BOOM</td>
			<td>760518191000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring x chromosomal aberrations in ovarian cells by using fluorescence in situ hybridization

Dünya çapında milyonlarca insan doğurganlıkla ilgili sorunlarla uğraşmaktadır. Azalmış doğurganlık, hatta infertilite, kromozomal anormalliklerin en yaygın olduğu genetik bozukluklar da dahil olmak üzere birçok farklı nedenden kaynaklanabilir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), insanlarda kromozomal anormallikleri tespit etmek için iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. FISH esas olarak sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerin spermatozoasındaki kromozomal anormalliklerin analizi için kullanılır. Ayrıca, bu teknik, yumurtalık disgenezine neden olduğu bilinen X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için kadınlarda da sıklıkla uygulanır. Bununla birlikte, lenfositlerde ve / veya bukkal hücrelerde X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında bilgi hala eksiktir.
Bu çalışmanın amacı, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için FISH'e dayalı iki yöntem sunarak kadınlarda X kromozomal anormallikleri ile ilgili temel araştırmaları ilerletmektir. İlk olarak, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan aşılanmamış yumurtalık korteks dokusunda izole yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza hücreleri ve stromal hücreler) X kromozomal içeriğini belirlemek için bir yöntem tanımlanmıştır. İkinci yöntem, uzun süreli aşılamadan sonra X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan immün sistemi baskılanmış farelere yumurtalık dokusunda yeni oluşan sekonder ve antral foliküllerin yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirleyerek kromozomal anormalliklerin folikülogenez üzerindeki etkisini değerlendirmeye yöneliktir. Her iki yöntem de X kromozomal anormallikleri olan kadınların üreme potansiyeli hakkında fikir edinmek için gelecekteki araştırmalarda yardımcı olabilir.

Aşılamadan önce izole edilmiş yumurtalık hücrelerinde FISH Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları göstermek için 45,X/46,XX (hasta A) veya 45,X/46,XX/47,XXX (hasta B) TS'li kadınlardan kriyokorunmuş over korteks dokusu kullanıldı. Hasta A'da lenfositlerin %50'sinde 45,X karyotip, %50'sinde 46,XX karyotip saptandı. B hastasında lenfositlerin %38'i 45,X, %28'i 46,XX ve %34'ü 47,XXX idi. Kontrol (kırmızı) olarak X kromozomu (yeşil) ve kromozom 18 için sentromere özgü prob...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization at JoVE.com

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Bu makalede, X kromozomal anomalileri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki over hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için floresan in situ hibridizasyona dayalı iki yöntem sunulmaktadır.

Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin FISH analizi, bu spesifik gruptaki yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için benzersiz bir tekniktir. Bu teknikler, X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda üreme potansiyeli hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı olabilir. Her iki yöntemin de gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmayı amaçladığını ve klinik uygulamada bir teşhis aracı olarak kullanılmak üzere tasarlanmadığını belirtmek önemlidir.Prosedürü gösteren, doğurganlık laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırmacı olan Ronald Peek ve patoloji bölümümüzden bir analist olan Milad Intezar olacaktır. Başlamak için, kriyoprezerve edilmiş veya çözülmüş yumurtalık korteks dokusunu bir neşter kullanarak birer birer milimetrelik küçük parçalara ayırın. Doku parçalarını enzimatik olarak dört litre önceden ısıtılmış L15'te 37 santigrat derecede 75 dakika boyunca sindirin.Sindirim karışımını her 15 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. % 10 Fetal Sığır Serumu veya FBS ile desteklenmiş dört mililitre soğuk L15 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Ayrışmış dokuyu, 500 mikrolitre L15 ortamında tekrar askıya almadan önce 500 g'da santrifüjleme ile sekiz mililitre soğuk L15 ortamı ile bir kez yıkayın.Büyük ölçüde bireysel stromal hücreler ve küçük foliküller içeren hücre süspansiyonunu plastik bir Petri kabına aktarın ve süspansiyonu stereo mikroskop altında inceleyin. 75 mikrometrelik plastik pipet kullanarak 50 mikrometreden küçük folikülleri manuel olarak seçin ve bunları dört santigrat derecede% 10 FBS ile desteklenen L15 ortamının damlacığına aktarın. Daha sonra saflaştırılmış folikülleri% 0.06 tripsin, mililitre EDTA başına bir miligram ve mililitre glikoz başına bir miligram çözeltisine aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyondan sonra, 75 mikrometrelik plastik pipet kullanarak korteks hücre süspansiyonundan yumurtalık stromal hücreleri elde edin. Floresan In Situ Hibridizasyon veya bireysel yumurtalık hücrelerinin FISH analizi için, tedavi edilen yumurtalık foliküllerini tripsin / EDTA / glikoz veya stromal hücrelerle beş mikrolitre 0.15 milimolar potasyum klorür damlacıklarına ve bir slayt üzerinde 15 mikrolitre DPBS damlacıklarına aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. Slaydı iki dakika boyunca 300 mikrolitre 0.05 milimolar potasyum klorür,% 7.5 asetik asit ve% 22.5 metanol içinde kurutun ve önceden sabitleyin.Fiksasyonu tamamlamak için slaytı iki dakika boyunca üçe bir metanol asetik asitle örtün. Sabitlemeden sonra, numuneyi 73 santigrat derecede taze hazırlanmış SSC'de iki kez yıkayın. 100 mikrolitre% 2 Proteinaz K ile örtün ve bir kapak kayması ile kapatın.Slaydı hibridizasyon istasyonunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kapak fişini çıkarın ve slaydı DPBS'de beş dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalama altında yıkayın. Numuneyi% 1 formaldehit ile beş dakika sabitleyin.Daha sonra slaydı DPBS'de yıkayın ve her biri iki dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarında seri olarak dehidrate edin. Numuneyi floresan olarak etiketlenmiş problarla hibridize etmeden önce havayla kurutun. Daha sonra, numuneye bir mikrolitre CEPX, bir mikrolitre CEP18 ve 18 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin ve slayta yapıştırılmış bir kapak kayması ile kapatın.Slaytı üç dakika boyunca 73 santigrat derecede denatürasyon için hibridizasyon istasyonuna aktarın, ardından 37 santigrat derecede bir gece inkübasyonu sırasında hibridizasyon yapın. Hibridizasyondan sonra, kapak kaymasını ve kalan yapıştırıcıyı slayttan çıkarın. Slaydı iki dakika boyunca 0.4X SSC,% 0.3 Ara-20'de 72 santigrat derecede yıkayın, ardından 2X SSC'de bir dakika ve % 0.1 Ara-20'de bir dakika inkübasyon yapın.Slaytı gösterildiği gibi kurutun ve DAPI içeren bir montaj ortamıyla kaplamadan önce karanlıkta havayla kurutun. Floresan mikroskobu ile analizden önce slaytı eksi 20 santigrat dereceye 10 dakika boyunca yerleştirin. Parafin kesitlerini melezleştirmek için, parafin şeridinden foliküller içeren bölümden önce veya sonra yeni bölümler seçin.Bir bölümü bir cam slayta monte edin ve 56 santigrat derecede bir ocakta 45 dakika kurutun. Bölümü 10 dakika boyunca ksilen içinde paraffinize edin, ardından slaydı% 99.5 etanol içine batırın ve beş dakika boyunca musluk suyunda durulayın. Slaytı 96 santigrat derecede 10 dakika boyunca hedef alma çözeltisiyle ön işlemden geçirin.Soğuduktan sonra, slaytı damıtılmış suda durulayın. Slaydı beş dakika boyunca 0.01 molar hidroklorik asitle tedavi edin, ardından 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca pepsin sindirimi izleyin. Slaydı tekrar hidroklorik asitte ve daha sonra PBS'de durulayın.Slaydı beş dakika boyunca %1 formaldehit PBS'de sabitleyin. Daha sonra slaytı PBS'de ve tekrar demineralize suda% 99.5 etanol içinde dehidre etmeden önce kısa bir süre durulayın. Önceden işlenmiş slayta beş mikrolitre prob CEP18 ve CEPX uygulayın.Ardından bir kapak fişi uygulayın ve alanı fotoğraf yapıştırıcı ile kapatın. Slaytı 10 dakika boyunca 80 santigrat derecede denatürasyon ve gece boyunca 37 santigrat derecede hibridizasyon için bir melezleştiriciye yerleştirin. Ertesi gün, slaytı SSC'de her biri beş dakika boyunca 42 santigrat derecede iki kez durulayın, ardından 73 santigrat derecede% 0.3 Nonidet P-40'ta iki dakika ve bir dakika durulayın.Yine, slaytı 2X SSC'de durulayın, ardından% 99.5 etanol ile kurutmadan önce damıtılmış suda durulayın. Kızağı hava ile kurutun ve DAPI içeren montaj ortamına monte edin. Hasta A'da kriyokorunmuş over korteks dokusunda lenfositlerin %50'sinde lenfosit, %45'inde X, %50'sinde 46, Hasta B'de XX.In lenfositlerin %38'inde 45, X, %28'inde 46, XX ve %34'ünde 47, XXX saptandı.Çevreleyen stromal hücreler de X kromozomal içeriği için analiz edildi. Yumurtalık korteks dokusunun enzimatik sindirimi, büyük ölçüde ayrışmış hücrelerin süspansiyonuna neden oldu, ancak tek bir granülazoz hücre tabakası ile çevrili sağlam bir oositten oluşan ilkel folikülleri bıraktı. Küçük foliküller, granülazis hücrelerinin kümelenmesi nedeniyle FISH sonrası sinyalleri yorumlamada zorluklar sağlamıştır.FISH'ten önce foliküllerin tripsin ile ek sindirimi, bireysel granülazis hücrelerinin foliküllerin yüzeyinde küresel bir morfolojiye büzülmesine neden oldu. Hematoksilin eozin boyaması, beş aylık ksenogreftlemeden sonra over korteks dokusunda morfolojik olarak normal sekonder ve antral foliküller gösterdi. Bu foliküllerin granüloz hücrelerinin X kromozomal içeriği FISH analizi ile belirlendi.Bouin çözeltisinde aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun sabitlenmesi, yeşil bir pus nedeniyle foliküler hücrelerde bulanık ve büyük ölçüde gizlenmiş floresan sinyallerle sonuçlandı. Buna karşılık, formaldehit içine sabitlenmiş yumurtalık korteks dokusu mükemmel floresan sinyalleri sağladı. Bu protokolün ana zorluğu, yumurtalık hücrelerinin izolasyonunda ve dokunun enzimatik sindiriminde yatmaktadır.Bu protokolden sapmak, işlem sırasında önemli miktarda yumurtalık hücresi kaybına neden olabilir ve bu, özellikle düşük yumurtalık rezervine sahip kadınlarda kaçınılmalıdır. Ek gen ekspresyon profillemesi, anöploid yumurtalık hücrelerinin folikülogenez üzerindeki etkisi ve dolayısıyla X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda erken yumurtalık yetmezliği süreci hakkında daha fazla bilgi edinmek için yararlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genetik

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

Doku özgü miRNA ifade profil oluşturma In Situ hibridizasyon fareyle kalp bölümleri içinde

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...