Name: adoptive transfer of il-33-stimulated macrophages into bleomycin-induced mouse models to study their effect on idiopathic pulmonary fibrosis in vivo
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00
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著者らは、江南大学の実験室管理の特別トピック:病理標本に基づくデジタルスライスライブラリの構築(JDSYS202223)および中国国家自然科学基金会(81800065)を認めています。

全ての実験は実験動物の世話と使用のための手引きに従って行った。すべての動物実験は、江南大学の実験動物福祉倫理委員会によって承認されました(JN No. 20211130m1720615[501])。
注:この研究では、合計10匹のオスのC57BL / 6マウスが6〜8週齢で体重20〜25 gを使用しました。研究の3つの実験グループには、それぞれ3匹のレシピエントマウスが含まれ、1匹の宿主マウス?...

<ol>
	<li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Th&#252;sen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment.">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li><li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages.">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li><li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases.">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897 (2021).</li><li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury.">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li><li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation.">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li><li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation.">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li><li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. 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この研究は、マクロファージを枯渇、分離、培養、および移植するための効果的な方法を提供し、マウスの肺線維症のメカニズムの研究に役立ちます。マウスマクロファージの枯渇には、気管投与、尾静脈注射、鼻吸入など、多くの方法があります11。この研究は、操作が簡単で肺マクロファージを効果的に枯渇させることができる鼻吸入法を最適化しました</...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

特発性肺線維症(IPF)は、多くの要因によって引き起こされるびまん性肺炎症性疾患です1。Th1およびTh2免疫応答のサイトカイン微小環境では、マクロファージは古典的に活性化されたマクロファージ(M1)および代替的に活性化されたマクロファージ(M2)に分極され得る。リポ多糖(LPS)またはサイトカインIFN-γは、M1マクロファージを分極させ、iNOS、IL-1、IL-6、TNF-α、およびIL-12を含む炎症誘発性サイトカインを産生するように誘導します。対照的に、II型サイトカインIL-4およびIL-13はM2マクロファージの分極を促進し、肺線維症を促進するTGF-βやPDGFなどのさまざまな線維芽細胞増殖促進因子を産生する可能性があります2。IPFの病理学的過程はマクロファージの活性化および浸潤を伴う。IPFは、サイトカインの放出を通じて損傷修復、炎症、および線維症を媒介します3。治療の選択肢は限られているため、IPFの分子病理学的メカニズムを探求することは、IPFの予防と治療のための新しい戦略を開発する上で大きな意味を持ちます。私たちのグループと他の研究者による以前の研究4,5は、IPF患者およびブレオマイシン(BLM)誘発IPFのマウスモデルにおけるIL-33の放出の増加を確認しています。IL-33は、線維症の際に上皮細胞および内皮細胞から放出され、マクロファージの活性化に関与し、線維芽細胞の異常増殖、白血球浸潤、および最終的には肺機能の喪失をもたらします5。現在のプロトコルでは、マウスモデルでのIPF発生を研究する手段として、IL-33刺激間質マクロファージ(IM)の肺胞への養子移入について説明しています。ここでは、IMを宿主マウスの肺組織から単離し、in vitroで培養し、IL-33で24時間刺激した後、気管注射によってレシピエントマウスの肺胞に養子的に移植した。刺激されたマウスマクロファージの直接収集とレシピエント肺胞へのそれらの養子移動は、肺線維症の程度を悪化させることがわかり、以前の研究と比較して線維症に対する刺激因子の影響をより明確に説明することができます6。この論文に記載されている技術により、研究者はIPFの発生における潜在的なサイトカインによって刺激されるマクロファージの機能を探索することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;DMEM</td>
			<td>Life technologies Biotechnology,USA</td>
			<td>1508012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arterial indwelling needle</td>
			<td>B Braun Melsingen AG,Germany</td>
			<td>21G15G8393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Accuri&#160;C6 Plus</td>
			<td>Becton Dickinson,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleomycin</td>
			<td>Biotang, USA</td>
			<td>Ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator</td>
			<td>Thermo Forma, USA</td>
			<td>Thermo Forma370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>R&#38;D Systems,USA</td>
			<td>1124F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c</td>
			<td>R&#38;D Systems,USA</td>
			<td>N418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish</td>
			<td>Thermo Forma, USA</td>
			<td>174926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clodronate liposomes&#160;</td>
			<td>Clodronate liposomes,Netherlands</td>
			<td>CI-150-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>10103578001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80</td>
			<td>R&#38;D Systems,USA</td>
			<td>521204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainer</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Life technologies,USA</td>
			<td>1047571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Eosin&#160;</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Technology,China</td>
			<td>06-570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 PCR detection system</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine recombinant factor IL-33</td>
			<td>Peprotech, USA</td>
			<td>210-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon microscope</td>
			<td>Nikon Corporation, Japan</td>
			<td>941185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, streptomycin</td>
			<td>Life technologies,USA</td>
			<td>877113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>Guangdong Huankai Microbial Technology ,China</td>
			<td>1535882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology Company,China</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Isolater</td>
			<td>Vazyme company,China</td>
			<td>R401-01-AA</td>
			<td>Total RNA extraction reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RWD Inhalation Anesthesia Machine</td>
			<td>Shenzhen Rayward Life Technology ,China</td>
			<td>R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-automatic paraffin slicer</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>LeicaRM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Premix Ex Taq</td>
			<td>Takara, Japan</td>
			<td>410800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Life Technologies, USA</td>
			<td>1627172</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adoptive transfer of il-33-stimulated macrophages into bleomycin-induced mouse models to study their effect on idiopathic pulmonary fibrosis in vivo

早期肺損傷による炎症反応は、特発性肺線維症(IPF)の発症の重要な原因の1つであり、マクロファージや好中球などの炎症細胞の活性化、およびTNF-α、IL-1β、およびIL-6などの炎症因子の放出を伴う。IL-33刺激に応答して活性化された肺間質マクロファージ(IM)によって引き起こされる初期の炎症は、IPFの病理学的過程において重要な役割を果たすことが知られている。このプロトコルは、IPFの発生を研究するために、IL-33によって刺激されたIMのマウスの肺への養子移入について説明しています。これには、宿主マウスの肺からの一次IMの単離と培養、続いてブレオマイシン(BLM)誘発IPFレシピエントマウス(クロドロネートリポソームによる処理によって以前に肺胞マクロファージが枯渇した)の肺胞への刺激IMの養子移入、およびそれらのマウスの病理学的評価が含まれます。代表的な結果は、IL-33刺激マクロファージの養子導入がマウスの肺線維症を悪化させることを示しており、マクロファージ養子導入実験の確立はIPF病理を研究するための優れた技術的手段であることを示唆しています。

ここで使用するプロトコルは、 図 1 のフローチャートにまとめられています。鼻からのクロドロネートリポソームの吸入(図2)は、成体C57BL/6マウスの肺マクロファージを枯渇させるために使用され、これは良好なレシピエントマウスモデルを作成しました。肺IMを別の未処理(宿主)マウスから単離し(図3A、B)、 ?...

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Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

このプロトコルは、肺間質マクロファージ(IM)の単離と、特発性肺線維症(IPF)の in vivo 研究を容易にすることができるマウスモデルにおける肺胞のIL-33刺激後のそれらの養子移植について説明しています。

IL-33刺激マクロファージのブレオマイシン誘導マウスモデルへの養子導入によるin vivo特発性肺線維症への影響の研究(英語)

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

このプロトコルは、特発性肺線維症のin vivo研究を容易にすることができるマウスモデルにおけるIL-33決定後の肺IMSの単離および養子移入を記載している。この技術により、研究者はIPFの発生における従来のサイトカインによってシミュレートされたマクロファージの機能を探索することができます。はじめに、冷蔵庫からクロドロネートリポソームのバイアルを取り出します。室温で30分間温め、数回反転させて均一な混合を確保します。滅菌吸引チップを有するピペットを用いて60マイクロリットルのクロドロネートリポソームを吸引する。コントロールおよび薬物を麻酔をかけたマウスの鼻腔内に滴下して投与する。各滴の後、マウスが薬を完全に吸い込み、均等に呼吸することを確認してください。レシピエントマウスの肺胞マクロファージが枯渇した後、麻酔をかけた宿主マウスの皮膚を75%アルコールとヨウ素で消毒することから始めます。はさみを使用して皮膚を切り裂き、心肺組織を露出させます。20ゲージの針を備えた注射器に10ミリリットルのPBSを吸引し、針の先端をマウスの右心房に挿入します。次に、外科用ハサミでマウスの下大静脈を切断し、肺組織が白くなるまで毎分10〜20ミリリットルの一定速度でマウスにPBSを手動で灌流します。さらに、肺組織を切除し、培養皿内の氷冷PBSに移します。肺組織を断片に切断し、1%コラゲナーゼAを含む15ミリリットルのDMEM培地を加えてマクロファージを分離し、摂氏37度の振とう台で100 RPMで30分間インキュベートします。肺組織懸濁液を20ミリリットルの注射器で約10回吸引して細かくします。懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過します。ろ液を400Gで10分間遠心分離します。上清を捨てた後、赤血球を3ミリリットルの細胞溶解バッファーで氷上で2〜3分間溶解します。150 Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを10ミリリットルのDMEMに再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して細胞を数えます。細胞を10センチメートルの付着細胞培養皿に播種し、摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートして、肺間質マクロファージを皿に接着させます。1時間後、上清および浮遊細胞を吸引する。10ミリリットルの新鮮で完全な培地を加え、8時間以上または一晩インキュベートします。単離された間質マクロファージを刺激するために、使用済み培養培地をインターロイキン33の完全培地と交換する。また、インターロイキン33の代わりにPBSを添加してコントロールプレートを作製する。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。肺間質マクロファージを解離するには、1ミリリットルの0.25%トリプシンで5分間処理します。次に、3ミリリットルの新鮮な培養完全培地を加えて消化を消し、細胞懸濁液を遠心分離して肺マクロファージを回収します。細胞を計数した後、細胞をPBSに再懸濁し、10〜50マイクロリットルの細胞当たり5倍の最終濃度となるようにする。間質性マクロファージの移動を開始するには、麻酔をかけたレシピエントマウスの手足を医療用テープで垂直プレートに固定し、綿棒を使用してマウスの舌を片側にそっと引っ張ります。挿管ランプをオンにした後、マウスの喉に当てて、舌の付け根に近い気管を確認します。22ゲージ挿管ランプと直径0.4ミリメートルのガイドワイヤーを使用して、留置針カニューレを気管に挿入します。挿管を終了するには、ガイドワイヤーを取り外し、カニューレをマウスの気管に押し込みます。次に、カニューレが気管に入るのが見られたら、気管を通して50マイクロリットルの細胞懸濁液をレシピエントマウスに注入します。24時間後、気管を介してブレオマイシンを投与し、特発性肺線維症を誘発する。また、等量の生理食塩水を対照群に投与する。21日後、線維症のマーカーの発現およびアシュクロフトスコアを評価することにより、肺線維症の重症度を決定する。HE染色は、インターロイキン33刺激マクロファージの養子移入が、対照と比較して、ブレオマイシン刺激マウスにおける肺組織破壊の程度を悪化させ、線維芽細胞凝集を増加させることを示した。アシュクロフトスコアの増加は、肺線維症の程度も示しています。養子移入インターロイキン33刺激間質マクロファージを含み、ブレオマイシンで処理したレシピエントマウスの肺組織におけるアルファSMAおよびフィブロネクチンのmRNAの発現レベルは、BLM処理された野生型マウスと比較して高かった。カニューレ内の細胞懸濁液が肺組織に完全に入ることができるように、500マイクロリットルの空気を1ミリメートルの注射器で直ちに肺に入れる必要があります。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

実験的転移とCTLの養子移入免疫療法のマウスモデル

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

免疫・感染学

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS) and has been used as an animal model for ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

気道上皮細胞上でのアポトーシス促進効果のリンパ球微粒子および検出の生成

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

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の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

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レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

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IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...