Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
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这项工作得到了ANR Jeune Chercheur（ANR0015TD），ATIP-Avenir计划，医学研究基金会（n°206548）和Vaincre Alzheimer基金会（eOTP：669122 LS 212527），I'Agence Nationale de la Recherche（ANR-11-EQPX-0029 / Morphoscope，ANR-10-INBS-04 / FranceBioImaging;ANR-11-IDEX-0003-02/萨克雷植物科学）。

1. 线粒体染色和邻近连接试验 （PLA）
<ol><li>板 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa 细胞，维持在 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% 非必需氨基酸，在 37 °C 和 5% CO2 下，在 13 mm 玻璃盖玻片中，在1.5 英寸 24 孔板中以稀释度允许 75%-90% 细胞汇合在手术当天。 注意：值得注意的是，在线粒体染色和PLA之前，HeLa细胞可以提交其他处理，...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

该协议旨在识别和量化MCS的细胞器间蛋白PLA相互作用，特别是在MERCS。该方案的新颖之处在于它将PLA与多个细胞器的标记，共聚焦显微镜和3D图像分析相结合，以定位和量化位于同一膜中的两种蛋白质之间的PLA相互作用，在这种情况下，在ER膜内与线粒体膜（MAM）或同时与MAM和LD非常接近。该协议可用作验证可能定位于特定MERCS的蛋白质的工具，但也可用于其他MCS。
自2006年开发...

细胞间通讯是真核细胞的一个决定性特征。细胞器交流的一种方式是形成膜接触位点（MCS），这是两个细胞器之间的紧密膜对立，由结构和功能蛋白（如系绳、脂质转移蛋白和钙通道）维持1。MCS可以在相似或不同的细胞器之间建立，它们介导细胞成分的交换，这对于维持细胞稳态很重要。迄今为止，已经鉴定了几种 MCS，包括内质网 （ER）-线粒体、ER-质膜 （PM） 和 ER-脂质液滴 （LD） 接触1。其中，ER和线粒体（MERCSs）之间形成的那些是研究最多的，因为它们参与调节多种细胞功能，包括脂质和钙稳态2。由于线粒体在很大程度上被排除在经典的囊泡运输途径之外，它们依靠MERCS及其分子成分从ER导入关键脂质或脂质前体。这些脂质在MERCS中的非囊泡运输确保了维持适当的线粒体脂质组成，以及它们的功能和结构完整性3。
鉴于MCS在各种细胞功能中的关键参与，在过去几年中，对更深入地了解其分子成分的兴趣大大增加。已经使用了几种基于成像的方法来提高对MCS的了解。其中，基于荧光探针的邻近连接测定法（PLA）已被广泛用作MCS丰度的指标，通过在内源水平4下检测细胞器间蛋白质-蛋白质相互作用（在40nm的检测范围内）。例如，MERCS已经通过使用几个线粒体-ER蛋白对之间的PLA进行可视化和定量，包括VDAC1-IP3R，GRP75-IP3R，CypD-IP3和PTPIP51-VAPB 5,6,7,8。尽管该技术已被用于检测和量化MCS 5,7,9,10,11中存在的细胞器间蛋白质 - 蛋白质相互作用，但大多数研究并未将PLA与细胞器染色相结合。因此，尚未开发出一种定量方法，可以测量PLA相互作用与相关细胞器之间的接近度。因此，到目前为止，在ER蛋白的情况下，它们在与其他细胞器接触的膜亚域内的相互作用尚未与它们在广泛分布的ER网络中的相互作用区分开来。
在这里，我们描述了一种方案，用于检测驻留在同一细胞器膜中的蛋白质之间的PLA相互作用，并分析它们与MCS中伴侣细胞器的膜的接近程度。该协议是基于两个前提开发的：1）先前的研究表明，在过表达条件下，ER脂质转移蛋白ORP5和ORP8在ER-线粒体和ER-PM MCSs 12,13,14,15上共定位和相互作用，ORP5定位在ER-LD接触16,17;2）现有技术，包括PLA，共聚焦显微镜，细胞器标记和3D成像分析。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

膜接触位点（MCS）是膜紧密接近的区域，允许并调节并列细胞器之间不同生物分子（即钙和脂质）的动态交换，而不涉及膜融合。MCS对于细胞稳态至关重要，其功能由常驻成分确保，常驻成分通常以多聚体蛋白质复合物的形式存在。MCS通常涉及内质网（ER），这是脂质合成和细胞钙储存的主要部位，对于细胞器（例如线粒体）尤其重要，这些细胞器被排除在经典囊泡运输途径之外。在过去的几年中，ER和线粒体之间的MCS已经被广泛研究，因为它们的功能强烈影响细胞代谢/生物能量学。在这些接触位点已经开始鉴定几种蛋白质，包括膜系、钙通道和脂质转移蛋白，因此提出了研究这些 MCS 组分的新方法和技术方法的需求。在这里，我们描述了一种由组合技术方法组成的协议，包括邻近连接测定（PLA），线粒体染色和3D成像分割，允许检测物理上彼此接近（>40nm）并且位于ER-线粒体MCS的同一膜上的蛋白质。例如，我们使用了两种ER锚定的脂质转移蛋白ORP5和ORP8，它们先前已被证明在ER-线粒体和ER-质膜MCS中相互作用和定位。通过将ORP5-ORP8 PLA与细胞成像软件分析相关联，可以估计ORP5-ORP8复合物与线粒体表面的距离，并确定约50%的ORP5-ORP8 PLA相互作用发生在靠近线粒体的ER亚域。

使用上述方案，我们检测了两种ER锚定脂质转移蛋白ORP5和ORP8的相互作用位点，并评估了它们在与其他细胞器（特别是线粒体）接触的ER膜亚域中的发生。为此，用红色线粒体标记物染色HeLa细胞中的线粒体网络，并使用一抗抗ORP5和抗ORP8固定后检测ORP5-ORP8 PLA绿色斑点，其特异性先前通过免疫荧光15进行测试。共聚焦图像显示，HeLa细胞中的内源性ORP5-ORP8 PLA相互作用发生在网状ER，皮...

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Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

由于对这些细胞结构及其组分的研究兴趣日益浓厚，对研究膜接触位点（MCS）的新方法的需求也在增长。在这里，我们提出了一种协议，该协议集成了以前可用的显微镜技术，以识别和量化驻留在MCS中的细胞器内和细胞器间蛋白质复合物。

通过邻近连接测定可视化和定量ER-线粒体接触部位的内源性细胞器内蛋白相互作用

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

我们的PLA方案允许识别和量化膜接触位点蛋白质之间的内源性相互作用。我们已经用它来研究内质网线粒体接触位点的两种内质网蛋白之间的相互作用。该技术将PLA与细胞器染色和细胞器距离分析相结合。它允许定位和量化细胞间膜接触位点蛋白质之间的相互作用。执行邻近连接测定或 PLA 和图像采集后，设置细胞分析软件以启动 MATLAB 并通过单击 Mac 操作系统中的选项 Imaris 或 Windows 中的编辑菜单来启动扩展。选择首选项，切换到自定义工具面板，然后设置路径。要将图像导入软件，请直接通过竞技场部分或使用允许批量转换的独立文件转换器将共聚焦堆栈图像转换为IMS文件。导入后，单击编辑，转到图像属性，然后选择图像几何图形以检查图像校准。检查体素大小是否与X和Y中实际图像的预期像素大小相对应，以及显微镜生成Z堆栈的步骤 Z.To 调整不同通道的对比度 单击菜单中的编辑，转到显示调整，然后选择显示调整。独立调整每个通道以优化每种颜色的显示。此步骤对于设置精确的阈值或检测弱对象至关重要。然后，单击编辑并选择裁剪 3D，通过裁剪图像将分析限制为单个单元格。要分析同一视野中的另一个单元格，请再次打开同一图像并以不同的方式裁剪。通过单击添加新光斑选项来检测在ORP5和ORP8相互作用位置生成的PLA信号，这将创建一组新对象并打开光斑检测向导。选择应执行点检测的通道。调整估计的XY直径，以帮助光斑检测算法找到感兴趣的对象。如果选择的值太高，附近的物体会融合，如果值太小，可能会检测到异常信号。现在，单击背景减法以在点检测之前删除图像背景，以增强感兴趣对象周围的局部对比度。通过在软件自动阈值中将质量保留为阈值参数来调整点检测阈值，或稍微修改此值以检测所有对象。点检测完成后，保存检测参数并重复使用它们来处理其他图像。然后，通过单击添加新表面以创建新对象并打开表面检测向导来检测线粒体网络以生成表面渲染。选取应在其上执行曲面创建的通道。应用高斯滤波器以获得更光滑的表面，方法是单击平滑复选框，并设置一个阈值，指示表面上可观察到的次要细节。然后，执行背景减法以增强局部对比度，并根据信号强度调整阈值以检测线粒体网络。通过在分类表面窗口中选择体素过滤器的数量，在表面上应用过滤器以从阈值中移除小残差，并使用上限和下限阈值以仅保留感兴趣的对象。曲面创建结束后，保存创建参数并重复使用它们来处理其他图像。要在创建的线粒体表面之外生成距离图，请在场景树框中选择线粒体表面。单击图像处理并选择表面功能，然后进行距离变换。将显示一个 MATLAB 扩展，要求用户选择是应该在对象表面外部还是内部计算地图。选择外表面物体以测量PLA点与线粒体表面之间的距离。生成地图后，它将在显示调整面板中显示为新通道。在这个通道中，每个像素都有一个对应于到最近线粒体的距离的值。选择之前在场景树框中生成的点，以测量每个点到最近线粒体的距离，并识别和可视化最近的线粒体。现在，在统计和详细日志中选择与距离图对应的通道的特定值和中心强度，以测量每个点中心的值，该值对应于其到距离图中最接近线粒体的距离。通过单击窗口左下角的软盘图标将数据导出为 CSV 文件。要根据斑点到线粒体的距离提取斑点子群，请在场景树中选择斑点，然后单击过滤器选项卡。根据此窗口中距离图对应的通道中心强度添加新的过滤器，通过将下限阈值设置为零微米，上限阈值设置为0.380微米来提取距离线粒体小于380纳米的斑点。通过按将所选内容复制到新点按钮以聚焦于所选光斑来执行复制步骤。内源性ORP5-ORP8 PLA的共聚焦图像显示与线粒体（通常称为线粒体相关ER膜）密切接触的网状ER，皮质ER和ER亚域中的HeLa细胞相互作用。3D成像分析显示，约50%的内源性ORP5-ORP8 PLA相互作用在线粒体相关ER膜上检测到。在共过表达ORP5和ORP8的细胞中，在线粒体相关ER膜上发生的ORP5-ORP8 PLA相互作用的百分比与在这些蛋白质以内源水平表达的细胞中观察到的百分比相似。ORP5和ORP8下调诱导PLA信号总数大幅减少，而它们的共过表达增加了PLA。在ORP5-PTPIP51和ORP8-PTPIP51偶中检测到PLA信号，其平均数量与ORP5-ORP8 PLA偶联相似，证实了ORP5和ORP8在ER-线粒体膜接触位点的定位。此外，使用转染有PHPLCD-RFP或mCherry-PLN1的HeLa细胞鉴定ORP5-ORP8 PLA在线粒体，ER和脂滴之间的三向接触位点中的ER质膜接触处的相互作用。与任何图像分析方法一样，图像质量是一个关键点，因此信号的优化对于自动检测物体具有决定性作用。该技术也可用于研究两个或多个细胞器之间的关联，正如我们最近在三方ER，线粒体，脂滴接触位点对ORP5和ORP8功能的研究所做的那样。该技术有助于细胞内通讯领域的其他研究，以识别新的多部分细胞器间关联。

Research

JoVE Journal

Biology

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科研

生物学

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在体内 G蛋白偶联受体相互作用光谱分辨的双光子显微镜定量

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

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检测信号效应复合物BMP4的下游使用原位解放军，接近结扎分析

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

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The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

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研究内质网和线粒体相互作用通过<em&gt;原位</em&gt;接近连接分析在固定细胞

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