Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), het ATIP-Avenir Program, de Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), en de Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plantenwetenschappen).

1. Mitochondriale kleuring en proximity ligation assay (PLA)
<ol><li>Plaat 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-cellen, onderhouden in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren bij 37 °C met 5% CO2, in 13 mm glazen afdekplaten in1,5 in 24-putplaten met een verdunning die 75% -90% celsamenvloeiing op de dag van de procedure mogelijk maakt. OPMERKING: Van belang is dat HeLa-cellen kunnen w...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

Dit protocol is ontworpen om inter-organel eiwit PLA interacties bij MCS'en, in het bijzonder bij MERCSs, te identificeren en te kwantificeren. De nieuwigheid van het protocol is dat het PLA combineert met de etikettering van meerdere organellen, confocale microscopie en 3D-beeldanalyse om PLA-interacties tussen twee eiwitten in hetzelfde membraan te lokaliseren en te kwantificeren, in dit geval binnen het ER-membraan in de nabijheid van het membraan van mitochondriën (MAM) of met de MAM en LDs tegelijkertijd. Dit proto...

Inter-organel communicatie is een bepalend kenmerk van eukaryote cellen. Een manier waarop organellen communiceren, is door membraancontactplaatsen (MCS'en) te vormen, die nauwe membraanopposities zijn tussen twee organellen die worden onderhouden door structurele en functionele eiwitten, zoals tethers, lipideoverdrachtseiwitten en calciumkanalen1. MCS'en kunnen worden vastgesteld tussen vergelijkbare of verschillende organellen en ze bemiddelen de uitwisseling van cellulaire componenten, wat belangrijk is voor het behoud van cellulaire homeostase. Tot op heden zijn verschillende MCS'en geïdentificeerd, waaronder endoplasmatisch reticulum (ER)-mitochondriën, ER-plasmamembraan (PM) en ER-lipidedruppel (LD) contacten1. Onder hen behoren die gevormd tussen het ER en de mitochondriën (MERCSs) tot de meest bestudeerde omdat ze betrokken zijn bij de regulatie van verschillende cellulaire functies, waaronder lipide- en calciumhomeostase2. Omdat mitochondriën grotendeels zijn uitgesloten van de klassieke vesiculaire transportroutes, vertrouwen ze op MERCS en op hun moleculaire bestanddelen om belangrijke lipiden of lipideprecursoren uit het ER te importeren. Het niet-vesiculaire transport van deze lipiden over MERCSs zorgt voor het behoud van een goede mitochondriale lipidesamenstelling, evenals hun functionele en structurele integriteit3.
Gezien de cruciale betrokkenheid van MCS'en bij verschillende cellulaire functies, is de interesse in het bieden van een dieper inzicht in hun moleculaire componenten de afgelopen jaren sterk toegenomen. Verschillende soorten op beeldvorming gebaseerde benaderingen zijn gebruikt om de kennis over MCS'en te vergroten. Onder hen is de fluorescentiesonde-gebaseerde proximity ligation assay (PLA) op grote schaal gebruikt als een indicator van de overvloed aan MCS'en door inter-organel eiwit-eiwitinteracties (in een detectiebereik van 40 nm) te detecteren op endogene niveaus4. MERCS'en zijn bijvoorbeeld gevisualiseerd en gekwantificeerd door PLA te gebruiken tussen verschillende mitochondriën-ER-eiwitparen, waaronder VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 en PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Hoewel deze technologie is gebruikt om inter-organel eiwit-eiwitinteracties te detecteren en te kwantificeren die aanwezig zijn bij de MCS 5,7,9,10,11, combineerden de meeste studies PLA niet met organelkleuring. Daarom is er nog geen kwantitatieve methode ontwikkeld waarmee de nabijheid tussen PLA-interacties en geassocieerde organellen kan worden gemeten. Tot nu toe is in het geval van ER-eiwitten hun interactie binnen membraansubdomeinen in contact met andere organellen dus niet onderscheiden van hun interactie binnen het wijd verspreide ER-netwerk.
Hier beschrijven we een protocol om PLA-interacties te detecteren tussen eiwitten die zich in het membraan van hetzelfde organel bevinden en om hun nabijheid tot het membraan van het partnerorganel in het MCS te analyseren. Dit protocol is ontwikkeld op basis van twee premissen: 1) eerdere studies die aantonen dat, in overexpressieomstandigheden, de ER-lipideoverdrachtseiwitten ORP5 en ORP8 co-lokaliseren en interageren op ER-mitochondriën en ER-PM MCSs 12,13,14,15 en dat ORP5 lokaliseert bij ER-LD-contacten 16,17; 2) bestaande technologieën, waaronder PLA, confocale microscopie, organeletikettering en 3D-beeldvormingsanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

Membraancontactplaatsen (MCS'en) zijn gebieden met nauwe membraannabijheid die de dynamische uitwisseling van diverse biomoleculen (d.w.z. calcium en lipiden) tussen de naast elkaar geplaatste organellen mogelijk maken en reguleren zonder dat er sprake is van membraanfusie. MCS'en zijn essentieel voor cellulaire homeostase en hun functies worden verzekerd door de residente componenten, die vaak bestaan als multimere eiwitcomplexen. MCS'en omvatten vaak het endoplasmatisch reticulum (ER), een belangrijke plaats van lipidesynthese en cellulaire calciumopslag, en zijn vooral belangrijk voor organellen, zoals de mitochondriën, die zijn uitgesloten van de klassieke vesiculaire transportroutes. In de afgelopen jaren zijn MCS'en tussen het ER en mitochondriën uitgebreid bestudeerd, omdat hun functies een sterke invloed hebben op het cellulaire metabolisme / bio-energetica. Verschillende eiwitten zijn begonnen te worden geïdentificeerd op deze contactplaatsen, waaronder membraanbinders, calciumkanalen en lipideoverdrachtseiwitten, waardoor de behoefte aan nieuwe methodologieën en technische benaderingen om deze MCS-componenten te bestuderen, toeneemt. Hier beschrijven we een protocol dat bestaat uit gecombineerde technische benaderingen, waaronder proximity ligation assay (PLA), mitochondriale kleuring en 3D-beeldvormingssegmentatie, waarmee eiwitten kunnen worden gedetecteerd die fysiek dicht (>40 nm) bij elkaar zijn en die zich op hetzelfde membraan bevinden bij ER-mitochondriale MCS'en. We gebruikten bijvoorbeeld twee ER-verankerde lipideoverdrachtseiwitten, ORP5 en ORP8, waarvan eerder is aangetoond dat ze interageren en lokaliseren bij ER-mitochondriën en ER-plasmamembraan MCS'en. Door de ORP5-ORP8 PLA te associëren met celbeeldvormingssoftware-analyse, was het mogelijk om de afstand van het ORP5-ORP8-complex tot het mitochondriale oppervlak te schatten en te bepalen dat ongeveer 50% van de ORP5-ORP8 PLA-interactie plaatsvindt op ER-subdomeinen in de nabijheid van mitochondriën.

Met behulp van het hierboven beschreven protocol detecteerden we de interactieplaatsen van twee ER-verankerde lipideoverdrachtseiwitten, ORP5 en ORP8, en beoordeelden we hun voorkomen bij ER-membraansubdomeinen in contact met andere organellen, in het bijzonder met de mitochondriën. Daarvoor werd het mitochondriale netwerk in HeLa-cellen gekleurd met een rode mitochondriale marker en werden ORP5-ORP8 PLA-groene vlekken gedetecteerd na fixatie met behulp van de primaire antilichamen anti-ORP5 en anti-ORP8, waarvan de spe...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

De behoefte aan nieuwe benaderingen voor het bestuderen van membraancontactplaatsen (MCS'en) is gegroeid als gevolg van de toenemende interesse in het bestuderen van deze cellulaire structuren en hun componenten. Hier presenteren we een protocol dat eerder beschikbare microscopietechnologieën integreert om intra-organel en inter-organel eiwitcomplexen die zich in MCS'en bevinden te identificeren en te kwantificeren.

Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Ons PLA-protocol maakt het mogelijk om endogene interactie tussen eiwitten op membraancontactplaatsen te identificeren en te kwantificeren. We hebben het gebruikt om de interactie tussen twee endoplasmatische reticulumeiwitten op endoplasmatisch reticulum mitochondriale contactplaatsen te bestuderen. Deze techniek combineert PLA met organelkleuringen en analyse van de afstanden van organellen.Het maakt het mogelijk om te lokaliseren en te kwantificeren in interactie tussen eiwitten op inter-organellen membraancontactplaatsen. Na het uitvoeren van proximity ligation assay, of PLA, en beeldacquisitie, stelt u de celanalysesoftware in om MATLAB te starten en een extensie te starten door op de optie Imaris in het Mac-besturingssysteem of het bewerkingsmenu in Windows te klikken. Selecteer de voorkeuren, ga naar het deelvenster Aangepaste gereedschappen en stel het pad in.Om de afbeeldingen in de software te importeren, converteert u de confocale stapelafbeeldingen naar een IMS-bestand, rechtstreeks via het arenagedeelte of met behulp van de zelfstandige bestandsconverter die batchconversie mogelijk maakt. Klik na het importeren op bewerken, ga naar afbeeldingseigenschappen en selecteer afbeeldingsgeometrie om de beeldkalibratie te controleren. Controleer of de voxelgrootte overeenkomt met de pixelgrootte die wordt verwacht voor de werkelijke afbeelding in X en Y, en de stap die door de microscoop is toegepast om de Z-stapel te genereren in Z.To het contrast van de verschillende kanalen aan te passen Klik op Bewerken in het menu, ga naar de weergaveaanpassing en selecteer Weergaveaanpassing weergeven.Pas elk kanaal afzonderlijk aan om de weergave van elke kleur te optimaliseren. Deze stap is essentieel om nauwkeurige drempelwaarden in te stellen of zwakke objecten te detecteren. Klik vervolgens op bewerken en selecteer 3D bijsnijden om de analyse te beperken tot één cel door de afbeelding bij te snijden.Als u een andere cel in hetzelfde gezichtsveld wilt analyseren, opent u dezelfde afbeelding opnieuw en snijdt u deze anders bij. Detecteer de PLA-signalen die worden gegenereerd op de locatie van ORP5- en ORP8-interactie door op de optie Nieuwe vlekken toevoegen te klikken, waarmee een nieuwe set objecten wordt gemaakt en de wizard voor spotdetectie wordt geopend. Selecteer het kanaal waarop de spotdetectie moet worden uitgevoerd.Pas de geschatte XY-diameter aan om het spotdetectiealgoritme te helpen de interessante objecten te vinden. Als de gekozen waarde te hoog is, zullen de nabijgelegen objecten fuseren en als de waarde te klein is, kunnen afwijkende signalen worden gedetecteerd. Klik nu op achtergrondaftrek om de achtergrond van de afbeelding te verwijderen vóór spotdetectie om het lokale contrast rond de interessante objecten te verbeteren.Pas de drempelwaarde voor spotdetectie aan door de kwaliteit als drempelparameter in de automatische drempelwaarde van de software te behouden of wijzig deze waarde enigszins om alle objecten te detecteren. Zodra de spotdetectie is voltooid, slaat u de detectieparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken. Detecteer vervolgens het mitochondriale netwerk om een oppervlakteweergave te genereren door te klikken op Nieuwe oppervlakken toevoegen om een nieuw object te maken en de oppervlaktedetectiewizard te openen.Selecteer het kanaal waarop het maken van het oppervlak moet worden uitgevoerd. Pas het Gauss-filter toe om een gladder oppervlak te verkrijgen door op het vloeiende selectievakje te klikken en een drempel in te stellen die de kleine details aangeeft die op het oppervlak waarneembaar zijn. Voer daarna een achtergrondaftrek uit om de lokale contrasten te verbeteren en pas de drempel aan om het mitochondriale netwerk te detecteren op basis van de intensiteit van het signaal.Pas een filter toe op het oppervlak om kleine resten van de drempel te verwijderen door het aantal voxels-filters in het venster Classificeren te selecteren en speel met de bovenste en onderste drempels om alleen de objecten van belang te houden. Zodra het maken van het oppervlak is voltooid, slaat u de aanmaakparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken. Als u een afstandskaart buiten het gecreëerde mitochondriale oppervlak wilt genereren, selecteert u het mitochondriënoppervlak in de scèneboomvak.Klik op beeldverwerking en selecteer de functie Oppervlakken, gevolgd door afstandstransformatie. Er verschijnt een MATLAB-extensie waarin de gebruiker wordt gevraagd te kiezen of de kaart buiten of binnen het objectoppervlak moet worden berekend. Selecteer het buitenoppervlakobject om de afstand tussen de PLA-vlekken en het oppervlak van de mitochondriën te meten.Zodra de kaart is gegenereerd, wordt deze weergegeven als een nieuw kanaal in het weergave-aanpassingsvenster. In dit kanaal heeft elke pixel een waarde die overeenkomt met de afstand tot de dichtstbijzijnde mitochondriën. Selecteer de vlekken die eerder zijn gegenereerd in de scèneboomdoos om de afstand van elk punt tot het dichtstbijzijnde mitochondrion te meten en identificeer en visualiseer de dichtstbijzijnde.Selecteer nu specifieke waarden en centrumintensiteit van het kanaal dat overeenkomt met de afstandskaart in de statistieken en het gedetailleerde logboek om de waarde van elk spotcentrum te meten, wat overeenkomt met de afstand tot het dichtstbijzijnde mitochondrion in de afstandskaart. Exporteer de gegevens als een CSV-bestand door op het diskettepictogram linksonder in het venster te klikken. Om een subpopulatie van vlekken te extraheren op basis van hun afstanden tot mitochondriën, selecteert u de vlekken in de scèneboom en klikt u op het tabblad Filters.Voeg een nieuw filter toe op basis van de centrumintensiteit van het kanaal dat overeenkomt met de afstandskaart in dit venster en extraheer de vlekken op minder dan 380 nanometer afstand van de mitochondriën door de onderste drempel in te stellen op nul micrometer en de bovenste drempel op 0,380 micrometer. Voer een duplicatiestap uit door op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe vlekken te drukken om u te concentreren op de geselecteerde vlekken. Confocale beelden van endogene ORP5-ORP8 PLA toonden interacties in de HeLa-cellen in de reticulaire ER-, corticale ER- en ER-subdomeinen in nauw contact met mitochondriën, gewoonlijk mitochondriën-geassocieerde ER-membranen genoemd.3D-beeldvormingsanalyse toonde aan dat ongeveer 50% van de endogene ORP5-ORP8 PLA-interacties werden gedetecteerd bij mitochondriën-geassocieerde ER-membranen. Het percentage ORP5-ORP8 PLA-interacties dat optreedt bij mitochondriën-geassocieerde ER-membranen in cellen die ORP5 en ORP8 co-overexpresseren, was vergelijkbaar met dat waargenomen in cellen waar deze eiwitten tot expressie kwamen op endogene niveaus. ORP5- en ORP8-downregulatie veroorzaakte een enorme afname van het totale aantal PLA-signalen, terwijl hun co-overexpressie PLA verhoogde.PLA-signalen werden gedetecteerd in ORP5-PTPIP51 en ORP8-PTPIP51 paren, en hun gemiddelde aantallen waren vergelijkbaar met het ORP5-ORP8 PLA-paar, wat de ORP5- en ORP8-lokalisatie op ER-mitochondriale membraancontactplaatsen bevestigde. Verder wordt de interactie van ORP5-ORP8 PLA bij ER-plasmamembraancontacten in een driewegcontactplaats tussen mitochondriën, het ER en lipidedruppels geïdentificeerd met behulp van HeLa-cellen getransfecteerd met PHPLCD-RFP of mCherry-PLN1. Zoals bij elke beeldanalysemethode is de beeldkwaliteit een belangrijk punt, dus de optimalisatie van het signaal is bepalend voor de automatische detectie van de objecten.Deze techniek kan ook worden gebruikt om de associaties tussen twee of meerdere cellulaire organellen te bestuderen, zoals we deden in onze recente studie over ORP5- en ORP8-functie op de driepartijen-ER, mitochondriën, lipidedruppels contactplaatsen. Deze techniek kan nuttig zijn in andere studies op het gebied van intracellulaire communicatie om nieuwe multipartiete interorganelassociaties te identificeren.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detectie van Signalering Effector-Complexen Stroomafwaarts van BMP4 gebruik In situ PLA, een Proximity Ligatie Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Voorbereiding, Imaging, en kwantificeren van Bacteriële Surface Motility Testen

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...