Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dall'ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), dal Programma ATIP-Avenir, dalla Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) e dalla Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).

1. Colorazione mitocondriale e saggio di legatura di prossimità (PLA)
<ol><li>Piastra 0,5 x 10 5-2 x 10 5 cellule HeLa, mantenute in terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di FBS, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di aminoacidi non essenziali a 37 °C con il 5% di CO2 , in vetrini coprioggetti da 13 mm in piastre da1,5 in 24 pozzetti a una diluizione che consente la confluenza cellulare del 75%-90% il giorno della procedura. NOTA: Da...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

Questo protocollo è stato progettato per identificare e quantificare le interazioni tra le proteine organelle del PLA a livello di MCS, in particolare a livello di MERCS. La novità del protocollo è che combina il PLA con la marcatura di organelli multipli, la microscopia confocale e l'analisi di immagini 3D per localizzare e quantificare le interazioni del PLA tra due proteine che risiedono nella stessa membrana, in questo caso all'interno della membrana ER in stretta prossimità con la membrana dei mitocondri (MAM) o...

La comunicazione tra gli organelli è una caratteristica distintiva delle cellule eucariotiche. Un modo in cui gli organelli comunicano è la formazione di siti di contatto di membrana (MCS), che sono strette opposizioni di membrana tra due organelli che sono mantenute da proteine strutturali e funzionali, come i legami, le proteine di trasferimento lipidico e i canali del calcio1. Le MCS possono essere stabilite tra organelli simili o diversi e mediano lo scambio di componenti cellulari, che è importante per mantenere l'omeostasi cellulare. Ad oggi, sono stati identificati diversi MCS, tra cui il reticolo endoplasmatico (ER)-mitocondri, i contatti ER-membrana plasmatica (PM) e ER-goccioline lipidiche (LD)1. Tra questi, quelli che si formano tra l'ER e i mitocondri (MERCS) sono tra i più studiati in quanto coinvolti nella regolazione di diverse funzioni cellulari, tra cui l'omeostasi lipidica e del calcio2. Poiché i mitocondri sono in gran parte esclusi dalle classiche vie di trasporto vescicolare, si affidano a MERCS e ai loro costituenti molecolari per importare lipidi chiave o precursori lipidici dal reticolo endoplasmatico. Il trasporto non vescicolare di questi lipidi attraverso i MERCS garantisce il mantenimento di una corretta composizione lipidica mitocondriale, nonché la loro integrità funzionale e strutturale3.
Dato il coinvolgimento cruciale delle MCS in varie funzioni cellulari, l'interesse nel fornire una comprensione più profonda dei loro componenti molecolari è notevolmente aumentato negli ultimi anni. Diversi tipi di approcci basati sull'imaging sono stati utilizzati per far progredire le conoscenze sugli MCS. Tra questi, il saggio di legatura di prossimità (PLA) basato su sonda di fluorescenza è stato ampiamente utilizzato come indicatore dell'abbondanza di MCS rilevando le interazioni proteina-proteina inter-organello (in un intervallo di rilevamento di 40 nm) a livelli endogeni4. Ad esempio, i MERCS sono stati visualizzati e quantificati utilizzando il PLA tra diverse coppie di proteine mitocondri-ER, tra cui VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 e PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Sebbene questa tecnologia sia stata utilizzata per rilevare e quantificare le interazioni proteina-proteina inter-organello presenti a MCS 5,7,9,10,11, la maggior parte degli studi non ha combinato il PLA con la colorazione degli organelli. Di conseguenza, non è stato ancora sviluppato un metodo quantitativo che consenta di misurare la prossimità tra le interazioni del PLA e gli organelli associati. Così, finora, nel caso delle proteine ER, la loro interazione all'interno dei sottodomini di membrana a contatto con altri organelli non è stata distinta dalla loro interazione all'interno della rete ER ampiamente distribuita.
Qui, descriviamo un protocollo per rilevare le interazioni del PLA tra proteine che risiedono nella membrana dello stesso organello e per analizzare la loro vicinanza alla membrana dell'organello partner al MCS. Questo protocollo è stato sviluppato sulla base di due premesse: 1) studi precedenti che dimostrano che, in condizioni di sovraespressione, le proteine di trasferimento lipidico ER ORP5 e ORP8 co-localizzano e interagiscono a livello dei mitocondri ER e dei MCS 12,13,14,15 dell'ER-PM e che ORP5 si localizza ai contatti ER-LD16,17; 2) tecnologie esistenti, tra cui PLA, microscopia confocale, marcatura di organelli e analisi di imaging 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

I siti di contatto con la membrana (MCS) sono aree di stretta vicinanza della membrana che consentono e regolano lo scambio dinamico di diverse biomolecole (ad esempio, calcio e lipidi) tra gli organelli giustapposti senza coinvolgere la fusione della membrana. Le MCS sono essenziali per l'omeostasi cellulare e le loro funzioni sono assicurate dai componenti residenti, che spesso esistono come complessi proteici multimerici. Le MCS spesso coinvolgono il reticolo endoplasmatico (ER), un importante sito di sintesi lipidica e di accumulo cellulare di calcio, e sono particolarmente importanti per gli organelli, come i mitocondri, che sono esclusi dalle classiche vie di trasporto vescicolare. Negli ultimi anni, le MCS tra l'ER e i mitocondri sono state ampiamente studiate, poiché le loro funzioni hanno un forte impatto sul metabolismo cellulare/bioenergetica. Diverse proteine hanno iniziato a essere identificate in questi siti di contatto, tra cui i legami di membrana, i canali del calcio e le proteine di trasferimento lipidico, sollevando così la necessità di nuove metodologie e approcci tecnici per studiare questi componenti MCS. Qui, descriviamo un protocollo costituito da approcci tecnici combinati, che includono il saggio di legatura di prossimità (PLA), la colorazione dei mitocondri e la segmentazione dell'imaging 3D, che consente il rilevamento di proteine che sono fisicamente vicine (>40 nm) tra loro e che risiedono sulla stessa membrana a MCS dei mitocondri ER. Ad esempio, abbiamo utilizzato due proteine di trasferimento lipidico ancorate al reticolo endoplasmatico, ORP5 e ORP8, che hanno precedentemente dimostrato di interagire e localizzarsi nei mitocondri del reticolo endoplasmatico e negli MCS della membrana plasmatica del reticolo endoplasmatico. Associando il PLA ORP5-ORP8 con l'analisi del software di imaging cellulare, è stato possibile stimare la distanza del complesso ORP5-ORP8 dalla superficie mitocondriale e determinare che circa il 50% dell'interazione PLA ORP5-ORP8 si verifica nei sottodomini ER in prossimità dei mitocondri.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo rilevato i siti di interazione di due proteine di trasferimento lipidico ancorate al reticolo endoplasmatico, ORP5 e ORP8, e valutato la loro presenza nei sottodomini di membrana del reticolo endoplasmatico a contatto con altri organelli, in particolare con i mitocondri. Per questo, la rete mitocondriale nelle cellule HeLa è stata colorata con un marcatore mitocondriale rosso e le macchie verdi del PLA ORP5-ORP8 sono state rilevate dopo la fissazione utilizzando gli ant...

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Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Il nostro protocollo PLA permette di identificare e quantificare l'interazione endogena tra proteine nei siti di contatto con la membrana. Lo abbiamo usato per studiare l'interazione tra due proteine del reticolo endoplasmatico nei siti di contatto mitocondriale del reticolo endoplasmatico. Questa tecnica combina il PLA con la colorazione degli organelli e l'analisi delle distanze degli organelli.Permette di localizzare e quantificare l'interazione tra proteine nei siti di contatto inter-organelli. Dopo aver eseguito il test di legatura di prossimità, o PLA, e l'acquisizione delle immagini, impostare il software di analisi cellulare per avviare MATLAB e avviare un'estensione facendo clic sull'opzione Imaris nel sistema operativo Mac o nel menu di modifica in Windows. Selezionare le preferenze, passare al pannello degli strumenti personalizzati e impostare il percorso.Per importare le immagini nel software, converti le immagini della pila confocale in un file IMS, direttamente tramite la sezione arena o utilizzando il convertitore di file autonomo che consente la conversione batch. Dopo l'importazione, fai clic su modifica, vai alle proprietà dell'immagine e seleziona la geometria dell'immagine per controllare la calibrazione dell'immagine. Verificare che la dimensione del voxel corrisponda alla dimensione in pixel prevista per l'immagine effettiva in X e Y e che il passo applicato dal microscopio per generare lo stack Z in Z.To regolare il contrasto dei diversi canali Fare clic su Modifica nel menu, andare alla regolazione del display e selezionare Mostra regolazione del display.Regola ogni canale in modo indipendente per ottimizzare la visualizzazione di ciascun colore. Questo passaggio è essenziale per impostare soglie precise o rilevare oggetti deboli. Quindi, fai clic su modifica e seleziona ritaglia 3D per limitare l'analisi a una singola cella ritagliando l'immagine.Per analizzare un'altra cella nello stesso campo visivo, aprite di nuovo la stessa immagine e ritagliatela in modo diverso. Rileva i segnali PLA generati nella posizione dell'interazione ORP5 e ORP8 facendo clic sull'opzione aggiungi nuovi punti, che crea un nuovo set di oggetti e apre la procedura guidata di rilevamento dei punti. Selezionare il canale su cui deve essere eseguito il rilevamento spot.Regolare il diametro XY stimato per aiutare l'algoritmo di rilevamento spot a trovare gli oggetti di interesse. Se il valore scelto è troppo alto, gli oggetti vicini si fonderanno e, se il valore è troppo piccolo, potrebbero essere rilevati segnali aberranti. Ora, fai clic sulla sottrazione dello sfondo per rimuovere lo sfondo dell'immagine prima del rilevamento del punto per migliorare il contrasto locale intorno agli oggetti di interesse.Regolare la soglia di rilevamento del punto mantenendo la qualità come parametro di soglia nella soglia automatica del software, oppure modificare leggermente questo valore per rilevare tutti gli oggetti. Una volta terminato il rilevamento spot, salvare i parametri di rilevamento e riutilizzarli per elaborare altre immagini. Quindi, rilevare la rete mitocondriale per generare un rendering della superficie facendo clic su aggiungi nuove superfici per creare un nuovo oggetto e aprire la procedura guidata di rilevamento della superficie.Selezionate il canale su cui deve essere eseguita la creazione della superficie. Applicare il filtro gaussiano per ottenere una superficie più liscia facendo clic sulla casella di controllo Arrotonda e impostando una soglia che indica i dettagli minori osservabili sulla superficie. Successivamente, eseguire una sottrazione di fondo per migliorare i contrasti locali e regolare la soglia per rilevare la rete mitocondriale in base all'intensità del segnale.Applicare un filtro sulla superficie per rimuovere piccoli residui dalla soglia selezionando il numero di voxel filtro nella finestra di classificazione della superficie e giocare con le soglie superiore e inferiore per mantenere solo gli oggetti di interesse. Una volta terminata la creazione della superficie, salvate i parametri di creazione e riutilizzateli per elaborare altre immagini. Per generare una mappa di distanza all'esterno della superficie mitocondriale creata, selezionare la superficie dei mitocondri nella casella dell'albero della scena.Fare clic su Elaborazione immagine e selezionare la funzione superfici, seguita dalla trasformazione della distanza. Verrà visualizzata un'estensione MATLAB che chiede all'utente di scegliere se la mappa deve essere calcolata all'esterno o all'interno della superficie dell'oggetto. Selezionare l'oggetto della superficie esterna per misurare la distanza tra i punti PLA e la superficie dei mitocondri.Una volta generata, la mappa viene visualizzata come un nuovo canale nel pannello di regolazione del display. In questo canale, ogni pixel ha un valore corrispondente alla distanza dai mitocondri più vicini. Selezionare i punti generati in precedenza nella casella dell'albero della scena per misurare la distanza da ciascun punto al mitocondrio più vicino e identificare e visualizzare quelli più vicini.Ora, seleziona i valori specifici e l'intensità del centro del canale corrispondente alla mappa della distanza nelle statistiche e nel registro dettagliato per misurare il valore di ogni centro spot, che corrisponde alla sua distanza dal mitocondrio più vicino alla mappa della distanza. Esporta i dati come file CSV facendo clic sull'icona del disco floppy in basso a sinistra della finestra. Per estrarre una sottopopolazione di macchie in base alla loro distanza dai mitocondri, selezionare le macchie nell'albero della scena e fare clic sulla scheda dei filtri.Aggiungi un nuovo filtro basato sull'intensità centrale del canale corrispondente alla mappa della distanza in questa finestra ed estrai i punti a meno di 380 nanometri di distanza dai mitocondri impostando la soglia inferiore a zero micrometri e la soglia superiore a 0,380 micrometri. Eseguire una fase di duplicazione premendo il pulsante Duplica selezione in nuovi punti per mettere a fuoco i punti selezionati. Le immagini confocali del PLA endogeno ORP5-ORP8 hanno mostrato interazioni nelle cellule HeLa nei sottodomini reticolari ER, corticali ER e ER a stretto contatto con i mitocondri, comunemente indicati come membrane ER associate ai mitocondri.L'analisi di imaging 3D ha rivelato che circa il 50% delle interazioni endogene ORP5-ORP8 PLA sono state rilevate a livello delle membrane ER associate ai mitocondri. La percentuale di interazioni PLA ORP5-ORP8 che si verificano nelle membrane ER associate ai mitocondri nelle cellule che co-sovraesprimono ORP5 e ORP8 era simile a quella osservata nelle cellule in cui queste proteine erano espresse a livelli endogeni. La sottoregolazione di ORP5 e ORP8 ha indotto una massiccia diminuzione del numero totale di segnali di PLA, mentre la loro co-sovraespressione ha aumentato il PLA.I segnali PLA sono stati rilevati nelle coppie ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51 e i loro numeri medi erano simili alla coppia PLA ORP5-ORP8, confermando la localizzazione di ORP5 e ORP8 nei siti di contatto della membrana ER-mitocondri. Inoltre, l'interazione del PLA ORP5-ORP8 a contatto con la membrana plasmatica dell'ER in un sito di contatto a tre vie tra mitocondri, ER e goccioline lipidiche viene identificata utilizzando cellule HeLa trasfettate con PHPLCD-RFP o mCherry-PLN1. Come in qualsiasi metodo di analisi delle immagini, la qualità dell'immagine è un punto chiave, quindi l'ottimizzazione del segnale è decisiva per il rilevamento automatico degli oggetti.Questa tecnica può essere utilizzata anche per studiare le associazioni tra due o più organelli cellulari, come abbiamo fatto nel nostro recente studio sulla funzione di ORP5 e ORP8 nei siti di contatto a tre parti ER, mitocondri e goccioline lipidiche. Questa tecnica può essere utile in altri studi nel campo della comunicazione intracellulare per identificare nuove associazioni multipartipartite tra gli organelli.

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Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avanzate tecniche di microscopia confocale per studiare le interazioni proteina-proteina e cinetica alle lesioni del DNA

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...