Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

이 작업은 ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir 프로그램, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) 및 Fondation Vaincre Alzheimer(eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences)를 참조하십시오.

1. 미토콘드리아 염색 및 근접 결찰 분석(PLA)
<ol><li>플레이트 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa 세포, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에서 유지되고 37°C에서 5%CO2, 시술 당일 75%-90% 세포 합류를 허용하는 희석액으로 24웰 플레이트의1.5에 13mm 유리 커버슬립. 참고: 참고로, HeLa 세포는 미토콘드리아 염색 및 PLA ?...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

이 프로토콜은 MCS, 특히 MERCS에서 세포 기관 간 단백질 PLA 상호작용을 식별하고 정량화하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜의 참신함은 PLA를 여러 세포 소기관의 라벨링, 컨포칼 현미경 및 3D 이미지 분석과 결합하여 동일한 멤브레인에 있는 두 단백질 간의 PLA 상호 작용을 현지화하고 정량화한다는 것입니다. 이 프로토콜은 특정 MERCS뿐만 아니라 다른 MCS에서도 잠재적으로 국소화되는 단백질을 검...

세포 기관 간 통신은 진핵 세포의 특징입니다. 세포 소기관이 소통하는 한 가지 방법은 밧줄, 지질 전달 단백질 및 칼슘 채널과 같은 구조적 및 기능적 단백질에 의해 유지되는 두 세포 기관 사이의 가까운 막 대립인 막 접촉 부위(MCS)를 형성하는 것입니다1. MCS는 유사하거나 다른 세포 기관 사이에서 확립될 수 있으며 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 세포 구성 요소의 교환을 매개합니다. 현재까지 소포체(ER)-미토콘드리아, ER-원형질막(PM) 및 ER-지질 액적(LD) 접촉을 포함한 여러 MCS가 확인되었습니다1. 그 중 ER과 미토콘드리아 사이에 형성되는 것들(MERCS)은 지질과 칼슘 항상성을 포함한 여러 세포 기능의 조절에 관여하기 때문에 가장 많이 연구된 것 중 하나이다2. 미토콘드리아는 고전적인 소포 수송 경로에서 크게 제외되기 때문에 MERCS와 분자 성분에 의존하여 ER에서 주요 지질 또는 지질 전구체를 가져옵니다. MERCS를 통한 이러한 지질의 비소포 수송은 적절한 미토콘드리아 지질 조성과 기능적 및 구조적 완전성의 유지를 보장합니다3.
다종 화학 물질 민감증이 다양한 세포 기능에 결정적으로 관여한다는 점을 감안할 때, 다종 화학 물질의 분자 성분에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 데 대한 관심이 지난 몇 년 동안 크게 증가했습니다. MCS에 대한 지식을 발전시키기 위해 여러 유형의 이미징 기반 접근 방식이 사용되었습니다. 그 중 형광 프로브 기반 근접 결찰 분석법(PLA)은 내인성 수준에서 세포 소기관 간 단백질-단백질 상호작용(검출 범위 40nm)을 검출하여 MCS의 풍부도를 나타내는 지표로 널리 사용되고 있다4. 예를 들어, MERCS는 VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 및 PTPIP51-VAPB 5,6,7,8을 포함한 여러 미토콘드리아-ER 단백질 쌍 사이의 PLA를 사용하여 시각화 및 정량화되었습니다. 이 기술은 MCS 5,7,9,10,11에 존재하는 세포 소기관 간 단백질-단백질 상호작용을 감지하고 정량화하는 데 사용되었지만 대부분의 연구에서는 PLA와 세포 소기관 염색을 결합하지 않았습니다. 결과적으로, PLA 상호 작용과 관련 세포 기관 사이의 근접성을 측정할 수 있는 정량적 방법은 아직 개발되지 않았습니다. 따라서 지금까지 ER 단백질의 경우 다른 세포 기관과 접촉하는 막 하위 영역 내에서의 상호 작용은 널리 분포된 ER 네트워크 내에서의 상호 작용과 구별되지 않았습니다.
여기에서는 동일한 세포 기관의 막에 있는 단백질 간의 PLA 상호 작용을 감지하고 MCS에서 파트너 세포 기관의 막에 대한 근접성을 분석하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 가지 전제에 기초하여 개발되었다: 1) 과발현 조건에서, ER 지질 전달 단백질 ORP5 및 ORP8이 ER-미토콘드리아 및 ER-PM MCSs 12,13,14,15에서 공동 국소화 및 상호작용하고, ORP5가 ER-LD 접촉 16,17에서 국소화됨을 보여주는 이전 연구; 2) PLA, 컨포칼 현미경, 세포 소기관 라벨링 및 3D 이미징 분석을 포함한 기존 기술.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

막 접촉 부위(MCS)는 막 융합을 포함하지 않고 병치된 세포 기관 사이의 다양한 생체 분자(즉, 칼슘 및 지질)의 동적 교환을 허용하고 조절하는 가까운 막 근접 영역입니다. MCS는 세포 항상성에 필수적이며, 그 기능은 종종 다량체 단백질 복합체로 존재하는 상주 성분에 의해 보장됩니다. MCS는 종종 지질 합성 및 세포 칼슘 저장의 주요 부위인 소포체(ER)를 포함하며, 고전적인 소포 수송 경로에서 제외되는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관에 특히 중요합니다. 지난 몇 년 동안 ER과 미토콘드리아 사이의 MCS는 그 기능이 세포 대사/생체 에너지에 큰 영향을 미치기 때문에 광범위하게 연구되었습니다. 이러한 접촉 부위에서 막 밧줄, 칼슘 채널 및 지질 전달 단백질을 포함한 여러 단백질이 확인되기 시작했으며, 따라서 이러한 MCS 구성 요소를 연구하기 위한 새로운 방법론과 기술적 접근의 필요성이 높아졌습니다. 여기에서는 근접 결찰 분석(PLA), 미토콘드리아 염색 및 3D 이미징 분할을 포함하는 결합된 기술 접근 방식으로 구성된 프로토콜을 설명하며, 이를 통해 물리적으로 서로 가까운(>40nm) 단백질을 검출할 수 있으며 ER-미토콘드리아 MCS에서 동일한 멤브레인에 상주합니다. 예를 들어, 우리는 이전에 ER-미토콘드리아 및 ER-원형질막 MCS에서 상호 작용하고 국소화되는 것으로 밝혀진 두 개의 ER 고정 지질 전달 단백질인 ORP5 및 ORP8을 사용했습니다. ORP5-ORP8 PLA를 세포 이미징 소프트웨어 분석과 연관시킴으로써, 미토콘드리아 표면으로부터 ORP5-ORP8 복합체의 거리를 추정하고, ORP5-ORP8 PLA 상호작용의 약 50%가 미토콘드리아에 근접한 ER 서브도메인에서 발생한다는 것을 결정할 수 있었다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 두 개의 ER 고정 지질 전달 단백질인 ORP5 및 ORP8의 상호 작용 부위를 감지하고 다른 세포 기관, 특히 미토콘드리아와 접촉하는 ER 막 하위 도메인에서 발생을 평가했습니다. 이를 위해 HeLa 세포의 미토콘드리아 네트워크를 적색 미토콘드리아 마커로 염색하고, 1차 항체인 항-ORP5 및 항-ORP8을 사용하여 고정 후 ORP5-ORP8 PLA 녹색 반점을 검출했으며, 이들의 특이성은 ?...

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Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

막 접촉 부위(MCS)를 연구하기 위한 새로운 접근법의 필요성은 이러한 세포 구조와 그 구성 요소 연구에 대한 관심이 증가함에 따라 증가했습니다. 여기에서는 MCS에 상주하는 세포 소기관 내 및 세포 기관 간 단백질 복합체를 식별하고 정량화하기 위해 이전에 사용 가능한 현미경 기술을 통합하는 프로토콜을 제시합니다.

근접 결찰 분석에 의한 ER-미토콘드리아 접촉 부위에서 내인성 세포 기관 내 단백질 상호 작용의 시각화 및 정량화

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

당사의 PLA 프로토콜을 사용하면 막 접촉 부위에서 단백질 간의 내인성 상호 작용을 식별하고 정량화할 수 있습니다. 우리는 소포체 미토콘드리아 접촉 부위에서 두 개의 소포체 단백질 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용했습니다. 이 기술은 PLA와 세포 소기관 염색 및 세포 소기관의 거리 분석을 결합합니다.그것은 세포 기관 간 세포 간 접촉 부위에서 단백질 사이의 상호 작용을 현지화하고 정량화 할 수 있습니다. 근접 결찰 분석(PLA)과 영상 획득을 수행한 후, MATLAB을 시작하고 Mac 운영 체제에서 Imaris 옵션을 클릭하거나 Windows에서 편집 메뉴를 클릭하여 확장 프로그램을 시작하도록 세포 분석 소프트웨어를 설정합니다. 환경 설정을 선택하고 사용자 정의 도구 패널로 변경한 다음 경로를 설정합니다.이미지를 소프트웨어로 가져오려면 아레나 섹션을 통해 직접 또는 일괄 변환이 가능한 독립형 파일 변환기를 사용하여 컨포칼 스택 이미지를 IMS 파일로 변환합니다. 가져온 후 편집을 클릭하고 이미지 속성으로 이동한 다음 이미지 지오메트리를 선택하여 이미지 보정을 확인합니다. 복셀 크기가 X와 Y의 실제 이미지에 대해 예상되는 픽셀 크기와 일치하는지 확인하고, 현미경으로 Z 스택을 생성하기 위해 적용한 단계를 Z.To 다른 채널의 대비를 조정합니다. 메뉴에서 편집을 클릭하고 디스플레이 조정으로 이동하여 디스플레이 조정 표시를 선택합니다.각 채널을 독립적으로 조정하여 각 색상의 표시를 최적화합니다. 이 단계는 정확한 임계값을 설정하거나 약한 물체를 감지하는 데 필수적입니다. 그런 다음 편집을 클릭하고 3D 자르기를 선택하여 이미지를 잘라내어 분석을 단일 셀로 제한합니다.동일한 시야에서 다른 셀을 분석하려면 동일한 이미지를 다시 열고 다르게 자릅니다. 새 스팟 추가 옵션을 클릭하여 ORP5 및 ORP8 상호 작용 위치에서 생성된 PLA 신호를 감지하면 새 객체 세트가 생성되고 스팟 감지 마법사가 열립니다. 스팟 감지를 수행할 채널을 선택합니다.추정된 XY 지름을 조정하면 스폿 검출 알고리즘이 관심 있는 물체를 쉽게 찾을 수 있습니다. 선택한 값이 너무 높으면 주변 물체가 융합되고 값이 너무 작으면 비정상적인 신호가 감지될 수 있습니다. 이제 배경 빼기를 클릭하여 스팟 감지 전에 이미지 배경을 제거하여 관심 개체 주변의 로컬 대비를 향상시킵니다.품질을 소프트웨어 자동 임계값의 임계값 매개변수로 유지하여 스팟 감지 임계값을 조정하거나 이 값을 약간 수정하여 모든 물체를 감지합니다. 스팟 검출이 완료되면 검출 파라미터를 저장하고 이를 재사용하여 다른 이미지를 처리합니다. 그런 다음 미토콘드리아 네트워크를 감지하여 새 표면 추가를 클릭하여 새 개체를 만들고 표면 감지 마법사를 열어 표면 렌더링을 생성합니다.지표면 작성을 수행할 채널을 선택합니다. 가우스 필터를 적용하면 매끄러운 확인란을 클릭하고 표면에서 관찰할 수 있는 사소한 세부 사항을 나타내는 임계값을 설정하여 더 매끄러운 표면을 얻을 수 있습니다. 그런 다음 배경 빼기를 수행하여 로컬 대비를 향상시키고 임계값을 조정하여 신호 강도에 따라 미토콘드리아 네트워크를 감지합니다.표면 분류 창에서 복셀 필터의 수를 선택하여 임계값에서 작은 잔차를 제거하기 위해 표면에 필터를 적용하고, 상한 및 하한 임계값을 사용하여 관심 있는 객체만 유지합니다. 표면 생성이 끝나면 생성 매개변수를 저장하고 이를 다시 사용하여 다른 이미지를 처리합니다. 생성된 미토콘드리아 표면 외부에 거리 맵을 생성하려면 장면 트리 상자에서 미토콘드리아 표면을 선택합니다.이미지 처리를 클릭하고 표면 기능을 선택한 다음 거리 변환을 선택합니다. 맵을 객체 표면의 바깥쪽에서 계산할지 아니면 안쪽에서 계산할지를 선택하도록 요청하는 MATLAB 확장 프로그램이 표시됩니다. PLA 반점과 미토콘드리아 표면 사이의 거리를 측정하기 위해 외부 표면 물체를 선택합니다.맵이 생성되면 디스플레이 조정 패널에 새 채널로 나타납니다. 이 채널에서 모든 픽셀은 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리에 해당하는 값을 갖습니다. 장면 트리 상자에서 이전에 생성된 스팟을 선택하여 각 지점에서 가장 가까운 미토콘드리아까지의 거리를 측정하고 가장 가까운 스팟을 식별하고 시각화합니다.이제 통계 및 상세 로그에서 거리 지도에 해당하는 채널의 특정 값과 중심 강도를 선택하여 거리 지도에서 미토콘드리아에 가장 가까운 거리에 해당하는 각 스폿 중심의 값을 측정합니다. 창 왼쪽 하단에 있는 플로피 디스크 아이콘을 클릭하여 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다. 미토콘드리아까지의 거리를 기준으로 스팟의 하위 모집단을 추출하려면 씬 트리에서 스폿을 선택하고 필터 탭을 클릭합니다.이 창에서 거리 맵에 해당하는 채널의 중심 강도를 기반으로 새 필터를 추가하고 하한 임계값을 0마이크로미터로 설정하고 상한 임계값을 0.380마이크로미터로 설정하여 미토콘드리아에서 380나노미터 미만의 지점을 추출합니다. 선택한 스팟에 초점을 맞추기 위해 새 스팟에 선택 영역 복제 버튼을 눌러 복제 단계를 수행합니다. 내인성 ORP5-ORP8 PLA의 컨포칼 이미지는 일반적으로 미토콘드리아 관련 ER 막이라고 하는 미토콘드리아와 밀접하게 접촉하는 망상 ER, 피질 ER 및 ER 하위 도메인의 HeLa 세포에서 상호 작용을 보여주었습니다.3D 이미징 분석에 따르면 미토콘드리아 관련 ER 막에서 내인성 ORP5-ORP8 PLA 상호 작용의 약 50%가 검출되었습니다. ORP5 및 ORP8을 공동 과발현하는 세포의 미토콘드리아 관련 ER 막에서 발생하는 ORP5-ORP8 PLA 상호작용의 백분율은 이들 단백질이 내인성 수준에서 발현된 세포에서 관찰된 것과 유사하였다. ORP5 및 ORP8 하향 조절은 PLA 신호의 총 수를 크게 감소시킨 반면, 이들의 동시 과발현은 PLA를 증가시켰다.PLA 신호는 ORP5-PTPIP51 및 ORP8-PTPIP51 커플에서 검출되었으며, 이들의 평균 수치는 ORP5-ORP8 PLA 커플과 유사하여 ER-미토콘드리아 막 접촉 부위에서 ORP5 및 ORP8 국소화를 확인하였다. 또한, 미토콘드리아, ER 및 지질 방울 사이의 3원 접촉 부위에서 ER 원형질막 접촉에서 ORP5-ORP8 PLA의 상호작용은 PHPLCD-RFP 또는 mCherry-PLN1로 형질감염된 HeLa 세포를 사용하여 확인됩니다. 모든 이미지 분석 방법과 마찬가지로 이미지 품질이 핵심이므로 신호의 최적화는 물체의 자동 감지에 결정적입니다.이 기술은 또한 3 자 ER, 미토콘드리아, 지질 방울 접촉 부위에서 ORP5 및 ORP8 기능에 대한 최근 연구에서했던 것처럼 두 개 또는 여러 세포 소기관 간의 연관성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 통신 분야의 다른 연구에서 새로운 다자간 세포 기관 간 연관성을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

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이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

연구

생물학

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

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Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

효과기 - 단지에게 사용 BMP4의 다운 스트림 신호의 감지 현장에서 괞찮아, 근접 내고 분석

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...