Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir-programmet, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), og Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay plantevitenskap).

1. Mitokondriell farging og nærhetsligeringsanalyse (PLA)
<ol><li>Plate 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-celler, vedlikeholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 1% ikke-essensielle aminosyrer ved 37 ° C med 5% CO2, i 13 mm glassdeksler i1,5 i 24-brønnsplater ved en fortynning som tillater 75% -90% cellekonfluens på prosedyredagen. MERK: Merk: HeLa-celler kan sendes til ytterligere behandlinger, for eksempel s...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

Denne protokollen ble designet for å identifisere og kvantifisere interorganelle protein PLA-interaksjoner ved MCS-er, spesielt ved MERCS-er. Nyheten av protokollen er at den kombinerer PLA med merking av flere organeller, konfokal mikroskopi og 3D-bildeanalyse for å lokalisere og kvantifisere PLA-interaksjoner mellom to proteiner som bor i samme membran, i dette tilfellet innenfor ER-membranen i nærheten av membranen til mitokondrier (MAM) eller med MAM og LD samtidig. Denne protokollen kan brukes som et verktøy for...

Interorganell kommunikasjon er en definerende egenskap for eukaryote celler. En måte organeller kommuniserer på er ved å danne membrankontaktsteder (MCS), som er nære membranopposisjoner mellom to organeller som opprettholdes av strukturelle og funksjonelle proteiner, som tetere, lipidoverføringsproteiner og kalsiumkanaler1. MCS kan etableres mellom lignende eller forskjellige organeller, og de formidler utvekslingen av cellulære komponenter, noe som er viktig for å opprettholde cellulær homeostase. Hittil har flere MCSer blitt identifisert, inkludert endoplasmatisk retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) og ER-lipiddråpe (LD) kontakter1. Blant dem er de som dannes mellom ER og mitokondriene (MERCS) blant de mest studerte, da de er involvert i reguleringen av flere cellulære funksjoner, inkludert lipid- og kalsiumhomeostase2. Siden mitokondrier i stor grad er utelukket fra de klassiske vesikulære transportveiene, er de avhengige av MERCS og deres molekylære bestanddeler for å importere viktige lipider eller lipidforløpere fra ER. Den ikke-vesikulære transporten av disse lipidene over MERCS sikrer opprettholdelse av riktig mitokondriell lipidsammensetning, samt deres funksjonelle og strukturelle integritet3.
Gitt den avgjørende involveringen av MCSer i forskjellige cellulære funksjoner, har interessen for å gi en dypere forståelse av deres molekylære komponenter økt kraftig de siste årene. Flere typer bildebaserte tilnærminger har blitt brukt for å fremme kunnskapen om MCS. Blant dem har fluorescenssondebasert nærhetsligeringsanalyse (PLA) blitt mye brukt som en indikator på overflod av MCSer ved å oppdage interorganelle protein-protein-protein-interaksjoner (i et deteksjonsområde på 40 nm) ved endogene nivåer4. For eksempel har MERCS blitt visualisert og kvantifisert ved å bruke PLA mellom flere mitokondrier-ER-proteinpar, inkludert VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 og PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Selv om denne teknologien har blitt brukt til å oppdage og kvantifisere interorganelle protein-protein-interaksjoner som er tilstede ved MCS 5,7,9,10,11, kombinerte de fleste studiene ikke PLA med organellfarging. Følgelig er det ikke utviklet en kvantitativ metode som gjør det mulig å måle nærheten mellom PLA-interaksjoner og tilhørende organeller ennå. Således, så langt, når det gjelder ER-proteiner, har deres interaksjon i membranunderdomener i kontakt med andre organeller ikke blitt skilt fra deres interaksjon i det vidt distribuerte ER-nettverket.
Her beskriver vi en protokoll for å oppdage PLA-interaksjoner mellom proteiner som ligger i membranen til samme organelle og for å analysere deres nærhet til membranen til partnerorganellen ved MCS. Denne protokollen ble utviklet basert på to premisser: 1) tidligere studier som viser at ER-lipidoverføringsproteinene ORP5 og ORP8 under overekspresjonsbetingelser samlokaliserer og interagerer ved ER-mitokondrier og ER-PM MCSer 12,13,14,15 og at ORP5 lokaliseres ved ER-LD-kontakter 16,17; 2) eksisterende teknologier, inkludert PLA, konfokalmikroskopi, organellmerking og 3D-bildeanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

Membrankontaktsteder (MCS) er områder med nær membrannærhet som tillater og regulerer den dynamiske utvekslingen av forskjellige biomolekyler (dvs. kalsium og lipider) mellom de sidestilte organellene uten å involvere membranfusjon. MCS er avgjørende for cellulær homeostase, og deres funksjoner sikres av de bosatte komponentene, som ofte eksisterer som multimere proteinkomplekser. MCS involverer ofte endoplasmatisk retikulum (ER), et viktig sted for lipidsyntese og cellulær kalsiumlagring, og er spesielt viktige for organeller, som mitokondriene, som er utelukket fra de klassiske vesikulære transportveiene. I de siste årene har MCS mellom ER og mitokondrier blitt grundig studert, da deres funksjoner sterkt påvirker cellulær metabolisme / bioenergetikk. Flere proteiner har begynt å bli identifisert på disse kontaktstedene, inkludert membranbånd, kalsiumkanaler og lipidoverføringsproteiner, og øker dermed behovet for nye metoder og tekniske tilnærminger for å studere disse MCS-komponentene. Her beskriver vi en protokoll bestående av kombinerte tekniske tilnærminger, som inkluderer nærhetsligeringsanalyse (PLA), mitokondrierfarging og 3D-bildesegmentering, som gjør det mulig å oppdage proteiner som er fysisk nær (>40 nm) til hverandre og som ligger på samme membran ved ER-mitokondrier MCS. For eksempel brukte vi to ER-forankrede lipidoverføringsproteiner, ORP5 og ORP8, som tidligere har vist seg å interagere og lokalisere ved ER-mitokondrier og ER-plasmamembran MCS. Ved å knytte ORP5-ORP8 PLA til cellebildebehandlingsprogramvareanalyse, var det mulig å estimere avstanden til ORP5-ORP8-komplekset fra mitokondrieoverflaten og bestemme at ca. 50% av ORP5-ORP8 PLA-interaksjonen skjer ved ER-underdomener i nærheten av mitokondrier.

Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor oppdaget vi interaksjonsstedene til to ER-forankrede lipidoverføringsproteiner, ORP5 og ORP8, og vurderte deres forekomst ved ER-membranunderdomener i kontakt med andre organeller, spesielt med mitokondriene. For det ble mitokondrienettverket i HeLa-celler farget med en rød mitokondriemarkør, og ORP5-ORP8 PLA grønne flekker ble detektert etter fiksering ved bruk av de primære antistoffene anti-ORP5 og anti-ORP8, hvis spesifisitet tidligere ble testet ved immunfluorescens<su...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Behovet for nye tilnærminger for å studere membrankontaktsteder (MCS) har vokst på grunn av økende interesse for å studere disse cellulære strukturer og deres komponenter. Her presenterer vi en protokoll som integrerer tidligere tilgjengelige mikroskopiteknologier for å identifisere og kvantifisere intraorganelle og interorganelle proteinkomplekser som ligger på MCS.

Visualisering og kvantifisering av endogene intraorganelle proteininteraksjoner på ER-mitokondrier kontaktsteder ved nærhetsligeringsanalyser

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Vår PLA-protokoll gjør det mulig å identifisere og kvantifisere endogen interaksjon mellom proteiner på membrankontaktsteder. Vi har brukt den til å studere samspillet mellom to endoplasmatiske retikulumproteiner på endoplasmatiske retikulum mitokondrielle kontaktsteder. Denne teknikken kombinerer PLA med organellfarginger og analyse av organelleravstander.Det gjør det mulig å lokalisere og kvantifisere i samspill mellom proteiner på membrankontaktsteder mellom organeller. Etter å ha utført nærhetsligeringsanalyse, eller PLA, og bildeopptak, konfigurerer du celleanalyseprogramvaren til å starte MATLAB og starte en utvidelse ved å klikke på alternativet Imaris i Mac-operativsystemet eller redigeringsmenyen i Windows. Velg innstillingene, bytt til panelet for egendefinerte verktøy, og angi banen.For å importere bildene til programvaren, konverter de konfokale stakkbildene til en IMS-fil, enten direkte gjennom arenaseksjonen eller ved hjelp av den frittstående filkonvertereren som tillater batchkonvertering. Etter importen, klikk på rediger, gå til bildeegenskaper og velg bildegeometri for å sjekke bildekalibreringen. Kontroller at voksestørrelsen tilsvarer pikselstørrelsen som forventes for det faktiske bildet i X og Y, og trinnet som brukes av mikroskopet for å generere Z-stakken i Z.To justere kontrasten til de forskjellige kanalene Klikk rediger i menyen, gå til skjermjusteringen og velg Vis skjermjustering.Juster hver kanal uavhengig av hverandre for å optimalisere visningen av hver farge. Dette trinnet er viktig for å angi presise terskler eller oppdage svake objekter. Klikk deretter rediger og velg beskjær 3D for å begrense analysen til en enkelt celle ved å beskjære bildet.Hvis du vil analysere en annen celle i samme synsfelt, åpner du det samme bildet på nytt og beskjærer det på en annen måte. Oppdag PLA-signalene som genereres på stedet for ORP5- og ORP8-interaksjon ved å klikke på alternativet Legg til nye flekker, som oppretter et nytt sett med objekter og åpner veiviseren for flekkdeteksjon. Velg kanalen som punktregistreringen skal utføres på.Juster den estimerte XY-diameteren for å hjelpe flekkdeteksjonsalgoritmen med å finne objektene av interesse. Hvis den valgte verdien er for høy, vil de nærliggende gjenstandene smelte sammen, og hvis verdien er for liten, kan avvikende signaler oppdages. Klikk nå på bakgrunnssubtraksjon for å fjerne bildebakgrunnen før punktdeteksjon for å forbedre den lokale kontrasten rundt objektene av interesse.Juster punktdeteksjonsterskelen ved å beholde kvaliteten som terskelparameter i programvarens automatiske terskel, eller endre denne verdien litt for å oppdage alle objektene. Når punktregistreringen er fullført, lagrer du deteksjonsparametrene og bruker dem på nytt til å behandle andre bilder. Deretter oppdager du mitokondrienettverket for å generere en overflategjengivelse ved å klikke på legg til nye overflater for å opprette et nytt objekt og åpne veiviseren for overflatedeteksjon.Velg kanalen som overflateopprettelsen skal utføres på. Bruk Gauss-filter for å få en jevnere overflate ved å klikke i avmerkingsboksen og angi en terskel som indikerer de mindre detaljene som kan observeres på overflaten. Etterpå utfører du en bakgrunnssubtraksjon for å forbedre de lokale kontrastene og justere terskelen for å oppdage mitokondrienettverket basert på signalets intensitet.Bruk et filter på overflaten for å fjerne små rester fra terskelverdien ved å velge filteret for antall voxels i vinduet klassifisere overflate, og lek med den øvre og nedre terskelen for å beholde bare objektene av interesse. Når overflateopprettelsen er over, lagrer du opprettelsesparametrene og bruker dem på nytt til å behandle andre bilder. Hvis du vil generere et avstandskart utenfor den opprettede mitokondrieoverflaten, velger du mitokondrieoverflaten i scenetreboksen.Klikk på bildebehandling og velg overflatefunksjon, etterfulgt av avstandstransformasjon. En MATLAB-utvidelse som ber brukeren velge om kartet skal beregnes utenfor eller inne i objektoverflaten, vises. Velg utvendig overflateobjekt for å måle avstanden mellom PLA-punktene og overflaten av mitokondriene.Når kartet er generert, vises det som en ny kanal i skjermjusteringspanelet. I denne kanalen har hver piksel en verdi som tilsvarer avstanden til nærmeste mitokondrier. Velg flekkene som tidligere ble generert i scenetreboksen for å måle avstanden fra hvert punkt til nærmeste mitokondrion, og identifiser og visualiser de nærmeste.Velg nå spesifikke verdier og senterintensitet for kanalen som tilsvarer avstandskartet i statistikken og detaljert logg for å måle verdien til hvert spotsenter, som tilsvarer avstanden til nærmest mitokondrie i avstandskartet. Eksporter dataene som en CSV-fil ved å klikke på diskettikonet nederst til venstre i vinduet. For å trekke ut en underpopulasjon av flekker basert på deres avstander til mitokondrier, velg flekkene i scenetreet og klikk på filterfanen.Legg til et nytt filter basert på senterintensiteten til kanalen som tilsvarer avstandskartet i dette vinduet, og trekk ut flekkene mindre enn 380 nanometer fra mitokondriene ved å sette den nedre terskelen til null mikrometer og den øvre terskelen til 0,380 mikrometer. Utfør et dupliseringstrinn ved å trykke på dupliser merking til nye flekker-knappen for å fokusere på de valgte stedene. Konfokale bilder av endogene ORP5-ORP8 PLA viste interaksjoner i HeLa-cellene i retikulære ER-, kortikale ER- og ER-subdomener i nær kontakt med mitokondrier, ofte referert til som mitokondriassosierte ER-membraner.3D-bildeanalyse viste at ca. 50 % av endogene ORP5-ORP8 PLA-interaksjoner ble detektert ved mitokondriassosierte ER-membraner. Prosentandelen av ORP5-ORP8 PLA-interaksjoner som forekommer ved mitokondriassosierte ER-membraner i celler som overuttrykker ORP5 og ORP8 samtidig, var lik den som ble observert i celler der disse proteinene ble uttrykt ved endogene nivåer. ORP5 og ORP8 nedregulering induserte en massiv reduksjon i det totale antallet PLA-signaler, mens deres co-overuttrykk økte PLA.PLA-signaler ble detektert i ORP5-PTPIP51 og ORP8-PTPIP51 par, og deres gjennomsnittlige tall var lik ORP5-ORP8 PLA-paret, noe som bekrefter ORP5 og ORP8 lokalisering på ER-mitokondrier membrankontaktsteder. Videre identifiseres samspillet mellom ORP5-ORP8 PLA ved ER-plasmamembrankontakter i et treveis kontaktsted mellom mitokondrier, ER og lipiddråper ved bruk av HeLa-celler transfeksjonert med PHPLCD-RFP eller mCherry-PLN1. Som i enhver bildeanalysemetode er bildekvaliteten et nøkkelpunkt, så optimaliseringen av signalet er avgjørende for automatisk deteksjon av objektene.Denne teknikken kan også brukes til å studere sammenhengen mellom to eller flere cellulære organeller, som vi gjorde i vår siste studie om ORP5 og ORP8-funksjon på treparts-ER, mitokondrier, lipiddråperkontaktsteder. Denne teknikken kan være nyttig i andre studier i det intracellulære kommunikasjonsfeltet for å identifisere nye multipartite interorganelle foreninger.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifisere Protein-protein interaksjons nettsteder Bruke Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Forberedelse, Imaging, og Kvantifisering av Bakteriell Surface Motility Analyser

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studier av endoplasmatiske retikulum og mitokondrier Interaksjoner med<em&gt; In Situ</em&gt; Nærhet hemorroider analysen i fikserte celler

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studiet av Protein-protein interaksjoner i Autophagy forskning

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avanserte AC Confocal mikroskopi teknikker for å studere Protein-protein interaksjoner og Kinetics på DNA lesjoner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...