Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
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Este trabalho foi apoiado pela ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), pelo Programa ATIP-Avenir, pela Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548), e pela Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Fitotecnia).

1. Coloração mitocondrial e ensaio de ligadura de proximidade (PLA)
<ol><li>Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 células HeLa, mantidas em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com10% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais a 37 °C com 5% de CO2, em lamínulas de vidro de 13 mm em placas de1,5 em 24 poços em uma diluição que permite 75%-90% de confluência celular no dia do procedimento. NOTA: É importante ressaltar q...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

Este protocolo foi projetado para identificar e quantificar interações inter-organelas de proteínas PLA em MCSs, em particular em MERCSs. A novidade do protocolo é que ele combina PLA com a marcação de múltiplas organelas, microscopia confocal e análise de imagens 3D para localizar e quantificar interações de PLA entre duas proteínas residentes na mesma membrana, neste caso dentro da membrana de RE em estreita proximidade com a membrana da mitocôndria (MAM) ou com o MAM e LDs simultaneamente. Este protocolo p...

A comunicação interorganela é uma característica definidora das células eucarióticas. Uma maneira pela qual as organelas se comunicam é formando sítios de contato com a membrana (MCSs), que são oposições de membrana próximas entre duas organelas que são mantidas por proteínas estruturais e funcionais, como amarrações, proteínas de transferência de lipídios e canais de cálcio1. Os SCGs podem ser estabelecidos entre organelas semelhantes ou diferentes e medeiam a troca de componentes celulares, o que é importante para a manutenção da homeostase celular. Até o momento, vários SCMs foram identificados, incluindo retículo endoplasmático (RE)-mitocôndrias, RE-membrana plasmática (PM) e contatos RE-gotículas lipídicas (DL)1. Dentre elas, as formadas entre o RE e as mitocôndrias (MERCSs) estão entre as mais estudadas, pois estão envolvidas na regulação de diversas funções celulares, incluindo a homeostase lipídica e docálcio2. Como as mitocôndrias são amplamente excluídas das vias de transporte vesicular clássicas, elas dependem do MERCS e de seus constituintes moleculares para importar lipídios chave ou precursores lipídicos do RE. O transporte não vesicular desses lipídios através dos MERCSs garante a manutenção da composição lipídica mitocondrial adequada, bem como sua integridade funcional e estrutural3.
Dado o envolvimento crucial dos MCSs em várias funções celulares, o interesse em fornecer uma compreensão mais profunda de seus componentes moleculares tem aumentado muito nos últimos anos. Vários tipos de abordagens baseadas em imagem têm sido usados para avançar o conhecimento sobre os SCGs. Dentre eles, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA) baseado em sonda de fluorescência tem sido amplamente utilizado como um indicador da abundância de MCSs por meio da detecção de interações proteína-proteína interorganela (em uma faixa de detecção de 40 nm) em níveis endógenos4. Por exemplo, MERCSs foram visualizados e quantificados usando PLA entre vários pares de proteínas mitocondria-RE, incluindo VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 e PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Embora essa tecnologia tenha sido utilizada para detectar e quantificar interações proteína-proteína interorganelas presentes no ACM 5,7,9,10,11, a maioria dos estudos não combinou PLA com coloração de organela. Consequentemente, um método quantitativo que permita medir a proximidade entre as interações do PLA e organelas associadas ainda não foi desenvolvido. Assim, até o momento, no caso das proteínas de RE, sua interação dentro de subdomínios de membrana em contato com outras organelas não foi distinguida de sua interação dentro da rede de RE amplamente distribuída.
Aqui, descrevemos um protocolo para detectar interações de PLA entre proteínas que residem na membrana da mesma organela e analisar sua proximidade com a membrana da organela parceira no MCS. Esse protocolo foi desenvolvido com base em duas premissas: 1) estudos prévios mostrando que, em condições de superexpressão, as proteínas de transferência lipídica ORP5 e ORP8 co-localizam e interagem em ER-mitocôndrias e ER-PM MCSs 12,13,14,15 e que ORP5 localiza-se em contatos ER-LD 16,17; 2) tecnologias existentes, incluindo PLA, microscopia confocal, marcação de organelas e análise de imagens 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

Sítios de contato com a membrana (MCSs) são áreas de proximidade da membrana que permitem e regulam a troca dinâmica de diversas biomoléculas (isto é, cálcio e lipídios) entre as organelas justapostas sem envolver a fusão da membrana. Os SCG são essenciais para a homeostase celular, e suas funções são asseguradas pelos componentes residentes, que muitas vezes existem como complexos proteicos multiméricos. Os SCMs frequentemente envolvem o retículo endoplasmático (RE), um importante local de síntese lipídica e armazenamento celular de cálcio, e são particularmente importantes para organelas, como as mitocôndrias, que são excluídas das vias clássicas de transporte vesicular. Nos últimos anos, os SCG entre o RE e as mitocôndrias têm sido extensivamente estudados, pois suas funções impactam fortemente o metabolismo celular/bioenergética. Várias proteínas começaram a ser identificadas nesses sítios de contato, incluindo cabos de membrana, canais de cálcio e proteínas de transferência de lipídios, levantando a necessidade de novas metodologias e abordagens técnicas para estudar esses componentes da MCS. Aqui, descrevemos um protocolo que consiste em abordagens técnicas combinadas, que incluem ensaio de ligadura de proximidade (PLA), coloração mitocondrial e segmentação de imagem 3D, que permite a detecção de proteínas fisicamente próximas (>40 nm) entre si e que residem na mesma membrana em MCSs de mitocôndrias de RE. Por exemplo, usamos duas proteínas de transferência lipídica ancoradas em RE, ORP5 e ORP8, que já demonstraram interagir e se localizar em MCSs de membrana plasmática de RE e ER-membrana plasmática. Ao associar o PLA ORP5-ORP8 com a análise de software de imagem celular, foi possível estimar a distância do complexo ORP5-ORP8 da superfície mitocondrial e determinar que cerca de 50% da interação ORP5-ORP8 PLA ocorre em subdomínios de RE próximos às mitocôndrias.

Usando o protocolo descrito acima, detectamos os locais de interação de duas proteínas de transferência lipídica ancoradas em RE, ORP5 e ORP8, e avaliamos sua ocorrência em subdomínios da membrana de RE em contato com outras organelas, em particular, com as mitocôndrias. Para tanto, a rede mitocondrial em células HeLa foi corada com marcador mitocondrial vermelho, e manchas verdes de PLA ORP5-ORP8 foram detectadas após fixação com os anticorpos primários anti-ORP5 e anti-ORP8, cuja especificidade foi previam...

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Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Nosso protocolo de PLA permite identificar e quantificar a interação endógena entre proteínas nos sítios de contato com a membrana. Nós o usamos para estudar a interação entre duas proteínas do retículo endoplasmático em sítios de contato mitocondrial do retículo endoplasmático. Esta técnica combina PLA com colorações de organelas e análise de distâncias de organelas.Permite localizar e quantificar a interação entre proteínas nos sítios de contato inter-organelas. Depois de realizar o ensaio de ligadura de proximidade, ou PLA, e aquisição de imagem, configure o software de análise de células para iniciar o MATLAB e iniciar uma extensão clicando na opção Imaris no sistema operacional Mac ou no menu de edição no Windows. Selecione as preferências, altere para o painel de ferramentas personalizadas e defina o caminho.Para importar as imagens para o software, converta as imagens da pilha confocal em um arquivo IMS, diretamente através da seção arena ou usando o conversor de arquivos autônomo que permite a conversão em lote. Após a importação, clique em editar, vá para propriedades da imagem e selecione a geometria da imagem para verificar a calibração da imagem. Verifique se o tamanho do voxel corresponde ao tamanho de pixel esperado para a imagem real em X e Y, e a etapa aplicada pelo microscópio para gerar a pilha Z em Z.To ajustar o contraste dos diferentes canais, clique em Editar no menu, vá para o ajuste de exibição e selecione Mostrar ajuste de exibição.Ajuste cada canal independentemente para otimizar a exibição de cada cor. Esta etapa é essencial para definir limites precisos ou detectar objetos fracos. Em seguida, clique em editar e selecione cortar 3D para limitar a análise a uma única célula cortando a imagem.Para analisar outra célula no mesmo campo de visão, abra a mesma imagem novamente e corte-a de forma diferente. Detecte os sinais PLA gerados no local da interação ORP5 e ORP8 clicando na opção adicionar novos pontos, que cria um novo conjunto de objetos e abre o assistente de detecção de pontos. Selecione o canal no qual a detecção de ponto deve ser executada.Ajuste o diâmetro XY estimado para ajudar o algoritmo de detecção de ponto a encontrar os objetos de interesse. Se o valor escolhido for muito alto, os objetos próximos se fundirão e, se o valor for muito pequeno, sinais aberrantes podem ser detectados. Agora, clique na subtração de fundo para remover o fundo da imagem antes da detecção de pontos para melhorar o contraste local em torno dos objetos de interesse.Ajuste o limite de detecção de ponto mantendo a qualidade como o parâmetro de limite no limite automático de software ou modifique ligeiramente esse valor para detectar todos os objetos. Quando a detecção de pontos estiver concluída, salve os parâmetros de detecção e reutilize-os para processar outras imagens. Em seguida, detecte a rede mitocondrial para gerar uma renderização de superfície clicando em adicionar novas superfícies para criar um novo objeto e abra o assistente de detecção de superfície.Selecione o canal no qual a criação da superfície deve ser executada. Aplique o filtro gaussiano para obter uma superfície mais lisa clicando na caixa de seleção lisa e definindo um limite indicando os pequenos detalhes observáveis na superfície. Em seguida, realizar uma subtração de fundo para melhorar os contrastes locais e ajustar o limiar para detectar a rede mitocondrial com base na intensidade do sinal.Aplique um filtro na superfície para remover pequenos resíduos do limite selecionando o filtro de número de voxels na janela classificar superfície e jogue com os limites superior e inferior para manter apenas os objetos de interesse. Quando a criação da superfície terminar, salve os parâmetros de criação e reutilize-os para processar outras imagens. Para gerar um mapa de distância fora da superfície mitocondrial criada, selecione a superfície mitocondrial na caixa da árvore de cena.Clique em processamento de imagem e selecione a função de superfícies, seguida de transformação de distância. Uma extensão MATLAB pedindo ao usuário para escolher se o mapa deve ser computado fora ou dentro da superfície do objeto aparecerá. Selecione o objeto de superfície externa para medir a distância entre os pontos de PLA e a superfície da mitocôndria.Uma vez que o mapa é gerado, ele aparece como um novo canal no painel de ajuste de exibição. Neste canal, cada pixel tem um valor correspondente à distância à mitocôndria mais próxima. Selecione os pontos previamente gerados na caixa da árvore de cena para medir a distância de cada ponto até a mitocôndria mais próxima, e identifique e visualize as mais próximas.Agora, selecione valores específicos e intensidade do centro do canal correspondente ao mapa de distância nas estatísticas e log detalhado para medir o valor de cada centro de ponto, que corresponde à sua distância para o mais próximo da mitocôndria no mapa de distância. Exporte os dados como um arquivo CSV clicando no ícone de disquete na parte inferior esquerda da janela. Para extrair uma subpopulação de manchas com base em suas distâncias para as mitocôndrias, selecione os pontos na árvore de cenas e clique na guia filtros.Adicione um novo filtro com base na intensidade central do canal correspondente ao mapa de distância nesta janela e extraia os pontos a menos de 380 nanômetros de distância da mitocôndria, definindo o limite inferior para zero micrômetros e o limite superior para 0,380 micrômetros. Execute uma etapa de duplicação pressionando o botão de seleção duplicada para novos pontos para se concentrar nos pontos selecionados. Imagens confocais de PLA ORP5-ORP8 endógeno mostraram interações nas células HeLa nos subdomínios RE reticular, RE cortical e RE em contato próximo com mitocôndrias, comumente referidas como membranas de RE associadas à mitocôndria.A análise de imagens 3D revelou que cerca de 50% das interações endógenas ORP5-ORP8 PLA foram detectadas em membranas de RE associadas à mitocôndria. A porcentagem de interações ORP5-ORP8 PLA que ocorrem nas membranas de RE associadas à mitocôndria em células que co-superexpressam ORP5 e ORP8 foi semelhante àquela observada em células onde essas proteínas foram expressas em níveis endógenos. A downregulation de ORP5 e ORP8 induziu uma diminuição maciça no número total de sinais de PLA, enquanto sua co-superexpressão aumentou o PLA.Sinais de PLA foram detectados nos casais ORP5-PTPIP51 e ORP8-PTPIP51, e seus números médios foram semelhantes ao par ORP5-ORP8 PLA, confirmando a localização de ORP5 e ORP8 nos sítios de contato da membrana ER-mitocôndria. Além disso, a interação de ORP5-ORP8 PLA em contatos da membrana plasmática de ER em um local de contato de três vias entre mitocôndrias, RE e gotículas lipídicas é identificada usando células HeLa transfectadas com PHPLCD-RFP ou mCherry-PLN1. Como em qualquer método de análise de imagem, a qualidade da imagem é um ponto chave, de modo que a otimização do sinal é decisiva para a detecção automática dos objetos.Esta técnica também pode ser usada para estudar as associações entre duas ou múltiplas organelas celulares, como fizemos em nosso estudo recente sobre a função de ORP5 e ORP8 nos sítios de contato de três partes de RE, mitocôndrias, gotículas lipídicas. Esta técnica pode ser útil em outros estudos no campo da comunicação intracelular para identificar novas associações multipartites inter-organelas.

Research

JoVE Journal

Biology

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Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

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Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Estudo do retículo endoplasmático e mitocôndrias Interações por<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidade Ligadura Ensaio em células fixas

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...