Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir-programmet, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) och Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).

1. Mitokondriell färgning och proximitetsligeringsanalys (PLA)
<ol><li>Platta 0,5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa-celler, bibehållna i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) kompletterat med 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin och 1 % icke-essentiella aminosyror vid 37 °C med 5 % CO2, i 13 mm glastäckglas i1,5 i 24-brunnars plattor vid en utspädning som tillåter 75 % -90 % cellsammanflöde på dagen för ingreppet. OBS: Värt att notera är att HeLa-celler kan genomg...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

Detta protokoll utformades för att identifiera och kvantifiera PLA-interaktioner mellan organellproteiner vid MCS, särskilt vid MERCS. Det nya med protokollet är att det kombinerar PLA med märkning av flera organeller, konfokalmikroskopi och 3D-bildanalys för att lokalisera och kvantifiera PLA-interaktioner mellan två proteiner som finns i samma membran, i detta fall inom ER-membranet i närheten av mitokondriemembranet (MAM) eller med MAM och LD samtidigt. Detta protokoll kan användas som ett verktyg för att val...

Interorganellkommunikation är en definierande egenskap hos eukaryota celler. Ett sätt på vilket organeller kommunicerar är genom att bilda membrankontaktställen (MCS), som är nära membranoppositioner mellan två organeller som upprätthålls av strukturella och funktionella proteiner, såsom tjuder, lipidöverföringsproteiner och kalciumkanaler1. MCS kan etableras mellan liknande eller olika organeller, och de förmedlar utbytet av cellulära komponenter, vilket är viktigt för att upprätthålla cellulär homeostas. Hittills har flera MCS identifierats, inklusive endoplasmatiskt retikulum (ER)-mitokondrier, ER-plasmamembran (PM) och ER-lipiddroppar (LD) kontakter1. Bland dem är de som bildas mellan ER och mitokondrierna (MERCS) bland de mest studerade eftersom de är involverade i regleringen av flera cellulära funktioner, inklusive lipid- och kalciumhomeostas2. Eftersom mitokondrier till stor del är uteslutna från de klassiska vesikulära transportvägarna förlitar de sig på MERCS och deras molekylära beståndsdelar för att importera viktiga lipider eller lipidprekursorer från ER. Den icke-vesikulära transporten av dessa lipider över MERCs säkerställer upprätthållandet av korrekt mitokondriell lipidsammansättning, såväl som deras funktionella och strukturella integritet3.
Med tanke på den avgörande involveringen av MCS i olika cellulära funktioner har intresset för att ge en djupare förståelse för deras molekylära komponenter ökat kraftigt under de senaste åren. Flera typer av bildbaserade metoder har använts för att öka kunskapen om MCS. Bland dem har fluorescensprobbaserad proximitetsligeringsanalys (PLA) använts i stor utsträckning som en indikator på förekomsten av MCS genom att detektera interorganellprotein-proteininteraktioner (i ett detektionsområde på 40 nm) vid endogena nivåer4. Till exempel har MERCs visualiserats och kvantifierats genom att använda PLA mellan flera mitokondrier-ER-proteinpar, inklusive VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 och PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Även om denna teknik har använts för att detektera och kvantifiera interaktioner mellan organeller och proteiner som finns vid MCS 5,7,9,10,11, kombinerade de flesta studierna inte PLA med organellfärgning. Följaktligen har en kvantitativ metod som gör det möjligt att mäta närheten mellan PLA-interaktioner och associerade organeller ännu inte utvecklats. Således, när det gäller ER-proteiner, har deras interaktion inom membransubdomäner i kontakt med andra organeller hittills inte särskiljts från deras interaktion inom det utbredda ER-nätverket.
Här beskriver vi ett protokoll för att detektera PLA-interaktioner mellan proteiner som finns i membranet i samma organell och för att analysera deras närhet till membranet i partnerorganellen vid MCS. Detta protokoll utvecklades baserat på två premisser: 1) tidigare studier som visar att, under överuttrycksförhållanden, ER-lipidöverföringsproteinerna ORP5 och ORP8 samlokaliseras och interagerar vid ER-mitokondrier och ER-PM MCS 12,13,14,15 och att ORP5 lokaliseras vid ER-LD-kontakter 16,17; 2) befintlig teknik, inklusive PLA, konfokalmikroskopi, organellmärkning och 3D-bildanalys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

Membrankontaktställen (MCS) är områden med nära membrannärhet som tillåter och reglerar det dynamiska utbytet av olika biomolekyler (dvs. kalcium och lipider) mellan de parallella organellerna utan att involvera membranfusion. MCS är viktiga för cellulär homeostas, och deras funktioner säkerställs av de inneboende komponenterna, som ofta existerar som multimera proteinkomplex. MCS involverar ofta det endoplasmatiska nätverket (ER), en viktig plats för lipidsyntes och cellulär kalciumlagring, och är särskilt viktiga för organeller, såsom mitokondrierna, som är uteslutna från de klassiska vesikulära transportvägarna. Under de senaste åren har MCS mellan ER och mitokondrier studerats i stor utsträckning, eftersom deras funktioner starkt påverkar cellulär metabolism/bioenergetik. Flera proteiner har börjat identifieras på dessa kontaktställen, inklusive membranbindningar, kalciumkanaler och lipidöverföringsproteiner, vilket ökar behovet av nya metoder och tekniska tillvägagångssätt för att studera dessa MCS-komponenter. Här beskriver vi ett protokoll som består av kombinerade tekniska tillvägagångssätt, som inkluderar proximitetsligeringsanalys (PLA), mitokondriefärgning och 3D-avbildningssegmentering, som möjliggör detektion av proteiner som är fysiskt nära (>40 nm) varandra och som finns på samma membran vid ER-mitokondrier MCS. Till exempel använde vi två ER-förankrade lipidöverföringsproteiner, ORP5 och ORP8, som tidigare har visat sig interagera och lokalisera vid ER-mitokondrier och ER-plasmamembran MCS. Genom att associera ORP5-ORP8 PLA med analys av cellavbildningsprogramvara var det möjligt att uppskatta avståndet mellan ORP5-ORP8-komplexet och fastställa att cirka 50 % av ORP5-ORP8 PLA-interaktionen sker vid ER-underdomäner i närheten av mitokondrier.

Med hjälp av det ovan beskrivna protokollet detekterade vi interaktionsställena för två ER-förankrade lipidöverföringsproteiner, ORP5 och ORP8, och bedömde deras förekomst vid ER-membransubdomäner i kontakt med andra organeller, i synnerhet med mitokondrierna. För detta färgades det mitokondriella nätverket i HeLa-celler med en röd mitokondriell markör, och ORP5-ORP8 PLA gröna fläckar detekterades efter fixering med de primära antikropparna anti-ORP5 och anti-ORP8, vars specificitet tidigare testats med...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Behovet av nya metoder för att studera membrankontaktställen (MCS) har ökat på grund av ett ökande intresse för att studera dessa cellulära strukturer och deras komponenter. Här presenterar vi ett protokoll som integrerar tidigare tillgängliga mikroskopitekniker för att identifiera och kvantifiera intraorganella och interorganella proteinkomplex som finns vid MCS.

Visualisering och kvantifiering av endogena intraorganella proteininteraktioner vid ER-mitokondrierkontaktställen genom närhetsligeringsanalyser

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Vårt PLA-protokoll gör det möjligt att identifiera och kvantifiera endogen interaktion mellan proteiner vid membrankontaktställen. Vi har använt den för att studera interaktionen mellan två endoplasmatiska retikulumproteiner vid endoplasmatiskt retikulum mitokondriella kontaktställen. Denna teknik kombinerar PLA med organellfärgning och analys av organellers avstånd.Det gör det möjligt att lokalisera och kvantifiera i interaktion mellan proteiner på interorganellers membrankontaktställen. Efter att ha utfört närhetsligeringsanalys, eller PLA, och bildinsamling, ställ in cellanalysprogramvaran för att starta MATLAB och starta ett tillägg genom att klicka på alternativet Imaris i Mac-operativsystemet eller redigeringsmenyn i Windows. Välj inställningarna, ändra till panelen för anpassade verktyg och ange sökvägen.För att importera bilderna till programvaran, konvertera de konfokala stackbilderna till en IMS-fil, antingen direkt via arenasektionen eller med hjälp av den fristående filkonverteraren som tillåter batchkonvertering. Efter importen klickar du på redigera, går till bildegenskaper och väljer bildgeometri för att kontrollera bildkalibreringen. Kontrollera att voxelstorleken motsvarar den pixelstorlek som förväntas för den faktiska bilden i X och Y, och steget som tillämpas av mikroskopet för att generera Z-stacken i Z.To justera kontrasten för de olika kanalerna klicka på Redigera i menyn, gå till visningsjusteringen och välj Visa visningsjustering.Justera varje kanal oberoende för att optimera visningen av varje färg. Detta steg är viktigt för att ställa in exakta tröskelvärden eller upptäcka svaga objekt. Klicka sedan på redigera och välj beskär 3D för att begränsa analysen till en enda cell genom att beskära bilden.Om du vill analysera en annan cell i samma synfält öppnar du samma bild igen och beskär den på ett annat sätt. Detektera PLA-signalerna som genereras på platsen för ORP5- och ORP8-interaktion genom att klicka på alternativet lägg till nya fläckar, vilket skapar en ny uppsättning objekt och öppnar guiden för punktdetektering. Välj den kanal som punktdetekteringen ska utföras på.Justera den uppskattade XY-diametern för att hjälpa punktdetekteringsalgoritmen att hitta de intressanta objekten. Om det valda värdet är för högt kommer de närliggande föremålen att smälta samman, och om värdet är för litet kan avvikande signaler upptäckas. Klicka nu på bakgrundssubtraktion för att ta bort bildbakgrunden före punktdetektering för att förbättra den lokala kontrasten runt de intressanta objekten.Justera tröskelvärdet för punktdetektering genom att behålla kvaliteten som tröskelparameter i tröskelvärdet för automatisk programvara, eller ändra det här värdet något för att identifiera alla objekt. När punktidentifieringen är klar sparar du detekteringsparametrarna och återanvänder dem för att bearbeta andra bilder. Identifiera sedan det mitokondriella nätverket för att generera en ytrendering genom att klicka på lägg till nya ytor för att skapa ett nytt objekt och öppna guiden för ytidentifiering.Välj den kanal som ytskapandet ska utföras på. Använd Gaussiskt filter för att få en jämnare yta genom att klicka på kryssrutan Utjämna och ange ett tröskelvärde som anger de mindre detaljer som kan observeras på ytan. Utför sedan en bakgrundssubtraktion för att förbättra de lokala kontrasterna och justera tröskeln för att detektera det mitokondriella nätverket baserat på signalens intensitet.Använd ett filter på ytan för att ta bort små rester från tröskelvärdet genom att välja filtret antal voxlar i fönstret klassificera yta och lek med de övre och nedre tröskelvärdena för att bara behålla objekten av intresse. När du har skapat ytan sparar du parametrarna för att skapa dem och återanvänder dem för att bearbeta andra bilder. Om du vill generera en avståndskarta utanför den skapade mitokondrieytan väljer du mitokondrieytan i scenträdsrutan.Klicka på bildbehandling och välj ytfunktion, följt av avståndstransformation. Ett MATLAB-tillägg som ber användaren att välja om kartan ska beräknas utanför eller inuti objektytan visas. Välj yttre ytobjekt för att mäta avståndet mellan PLA-punkterna och mitokondriernas yta.När kartan har genererats visas den som en ny kanal i visningsjusteringspanelen. I den här kanalen har varje pixel ett värde som motsvarar avståndet till närmaste mitokondrier. Välj de punkter som tidigare genererats i scenträdsrutan för att mäta avståndet från varje punkt till den närmaste mitokondrien och identifiera och visualisera de närmaste.Välj nu specifika värden och mittintensitet för kanalen som motsvarar avståndskartan i statistiken och den detaljerade loggen för att mäta värdet på varje punktcentrum, vilket motsvarar dess avstånd till den närmaste mitokondrien på avståndskartan. Exportera data som en CSV-fil genom att klicka på diskettikonen längst ner till vänster i fönstret. Om du vill extrahera en delpopulation av fläckar baserat på deras avstånd till mitokondrier markerar du fläckarna i scenträdet och klickar på fliken filter.Lägg till ett nytt filter baserat på kanalens mittintensitet som motsvarar avståndskartan i det här fönstret och extrahera fläckarna mindre än 380 nanometer från mitokondrierna genom att ställa in det nedre tröskelvärdet till noll mikrometer och det övre tröskelvärdet till 0,380 mikrometer. Utför ett dupliceringssteg genom att trycka på knappen Duplicera markering till nya fläckar för att fokusera på de markerade fläckarna. Konfokala bilder av endogent ORP5-ORP8 PLA visade interaktioner i HeLa-cellerna i de retikulära ER-, kortikala ER- och ER-subdomänerna i nära kontakt med mitokondrier, vanligen kallade mitokondrier-associerade ER-membran.3D-bildanalys visade att cirka 50 % av endogena ORP5-ORP8 PLA-interaktioner detekterades vid mitokondrieassocierade ER-membran. Andelen ORP5-ORP8 PLA-interaktioner som inträffade vid mitokondrieassocierade ER-membran i celler som samuttryckte ORP5 och ORP8 liknade den som observerades i celler där dessa proteiner uttrycktes på endogena nivåer. ORP5 och ORP8 nedreglering inducerade en massiv minskning av det totala antalet PLA-signaler, medan deras sam-överuttryck ökade PLA.PLA-signaler detekterades i ORP5-PTPIP51- och ORP8-PTPIP51-par, och deras genomsnittliga antal liknade ORP5-ORP8 PLA-paret, vilket bekräftar ORP5- och ORP8-lokalisering vid ER-mitokondriemembrankontaktställen. Vidare identifieras interaktionen mellan ORP5-ORP8 PLA vid ER-plasmamembrankontakter i ett trevägskontaktställe mellan mitokondrier, ER och lipiddroppar med hjälp av HeLa-celler transfekterade med PHPLCD-RFP eller mCherry-PLN1. Som i alla bildanalysmetoder är bildkvaliteten en nyckelpunkt, så optimeringen av signalen är avgörande för den automatiska detekteringen av objekten.Denna teknik kan också användas för att studera sambanden mellan två eller flera cellulära organeller, som vi gjorde i vår senaste studie om ORP5- och ORP8-funktionen vid trepartskontaktställena för ER, mitokondrier och lipiddroppar. Denna teknik kan vara till hjälp i andra studier inom intracellulär kommunikation för att identifiera nya flerdelade interorganellassociationer.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein interaktioner In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Upptäckt av signalering Effektenheter-komplex Nedströms BMP4 Använda På plats PLA, en närhet Ligation analys

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Identifiera protein-proteininteraktion webbplatser Använda peptid Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Förberedelse, Imaging, och kvantifiering av bakterie Surface Motility Analyser

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Studie av endoplasmatiskt retikulum och Mitochondria Interaktioner av<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligation Assay i fixerade celler

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Studie av Protein-protein interaktioner i autofagi forskning

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avancerad konfokalmikroskopi tekniker för att studera Protein-protein interaktioner och kinetik på DNA lesioner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...