Name: visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Bu çalışma ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir Programı, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) ve Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Bitki Bilimleri).

1. Mitokondriyal boyama ve yakınlık ligasyon testi (PLA)
<ol><li>Plaka 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) %10 FBS, %1 penisilin / streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO2 ile,% 75 -% 90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede1.5 içinde 24 oyuklu plakalarda, işlem gününde% 75-90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede. NOT: HeLa hücreleri, mitokondriya...

<ol>
	<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+together+to+define+membrane+contact+sites.">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287 (2019).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAM+(mitochondria-associated+membranes)+in+mammalian+cells:+Lipids+and+beyond.">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li><li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface.">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy.">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li><li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo.">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443 (2021).</li><li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS/FTD-associated+FUS+activates+GSK-3&#946;+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations.">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3&#946; to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li><li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells.">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899 (2016).</li><li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ER/mitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation.">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074 (2021).</li><li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2++homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production.">&#945;-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li><li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI4P/phosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts.">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li><li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/ORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function.">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li><li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4,+5-biphosphate+(PtdIns(4,5)P+2)+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane.">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757 (2017).</li><li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5/8+and+MIB/MICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine.">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364 (2022).</li><li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI(4)P+on+lipid+droplets.">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162 (2020).</li><li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites.">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107 (2022).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li></ol>

Bu protokol, MCS'lerde, özellikle MERCS'lerde organeller arası protein PLA etkileşimlerini tanımlamak ve ölçmek için tasarlanmıştır. Protokolün yeniliği, aynı zarda bulunan iki protein arasındaki PLA etkileşimlerini lokalize etmek ve ölçmek için PLA'yı çoklu organellerin etiketlenmesi, konfokal mikroskopi ve 3D görüntü analizi ile birleştirmesidir, bu durumda ER zarı içinde mitokondri zarı (MAM) veya MAM ve LD'ler ile aynı anda. Bu protokol, belirli MERCS'lerde ve aynı zamanda diğer MCS'lerd...

Organeller arası iletişim, ökaryotik hücrelerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Organellerin iletişim kurmasının bir yolu, bağlar, lipid transfer proteinleri ve kalsiyum kanalları gibi yapısal ve fonksiyonel proteinler tarafından korunan iki organel arasındaki yakın zar karşıtlıkları olan zar temas bölgeleri (MCS'ler) oluşturmaktır1. MCS'ler benzer veya farklı organeller arasında kurulabilir ve hücresel homeostazı korumak için önemli olan hücresel bileşenlerin değişimine aracılık ederler. Bugüne kadar, endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri, ER-plazma membranı (PM) ve ER-lipid damlacık (LD) kontakları1 dahil olmak üzere çeşitli MCS tanımlanmıştır. Bunlar arasında, ER ve mitokondri (MERCS'ler) arasında oluşanlar, lipid ve kalsiyum homeostazı2 dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynadıkları için en çok çalışılanlar arasındadır. Mitokondri, klasik veziküler taşıma yollarından büyük ölçüde dışlandığından, ER'den anahtar lipitleri veya lipid öncüllerini ithal etmek için MERCS'ye ve moleküler bileşenlerine güvenirler. Bu lipitlerin MERCS'ler arasında veziküler olmayan taşınması, uygun mitokondriyal lipid bileşiminin yanı sıra fonksiyonel ve yapısal bütünlüklerinin korunmasını sağlar3.
MCS'lerin çeşitli hücresel fonksiyonlara önemli katılımı göz önüne alındığında, moleküler bileşenlerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına olan ilgi son yıllarda büyük ölçüde artmıştır. MCS'ler hakkındaki bilgileri ilerletmek için çeşitli görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bunlar arasında, floresan prob tabanlı yakınlık ligasyon testi (PLA), endojen seviyelerdeorganeller arası protein-protein etkileşimlerini (40 nm'lik bir tespit aralığında) tespit ederek MCS'lerin bolluğunun bir göstergesi olarak yaygın olarak kullanılmıştır 4. Örneğin, MERCS'ler, VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 ve PTPIP51-VAPB 5,6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli mitokondri-ER protein çiftleri arasında PLA kullanılarak görselleştirildi ve ölçüldü. Bu teknoloji, MCS 5,7,9,10,11'de bulunan organeller arası protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılmış olsa da, çalışmaların çoğu PLA'yı organel boyama ile birleştirmemiştir. Sonuç olarak, PLA etkileşimleri ve ilişkili organeller arasındaki yakınlığın ölçülmesine izin veren nicel bir yöntem henüz geliştirilmemiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, ER proteinleri söz konusu olduğunda, diğer organellerle temas halinde olan zar alt alanları içindeki etkileşimleri, yaygın olarak dağılmış ER ağı içindeki etkileşimlerinden ayırt edilmemiştir.
Burada, aynı organelin zarında bulunan proteinler arasındaki PLA etkileşimlerini tespit etmek ve bunların MCS'deki ortak organelin zarına yakınlığını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol iki öncül temelinde geliştirilmiştir: 1) aşırı ekspresyon koşullarında, ER lipid transfer proteinleri ORP5 ve ORP8'in ER-mitokondri ve ER-PM MCS'lerde 12,13,14,15 birlikte lokalize olduğunu ve etkileşime girdiğini ve ORP5'in ER-LD temaslarındalokalize olduğunu gösteren önceki çalışmalar 16,17; 2) PLA, konfokal mikroskopi, organel etiketleme ve 3D görüntüleme analizi dahil olmak üzere mevcut teknolojiler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21236.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular glass coverslips 13mm no. 1.5</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>L46R13-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMXRos red MitoTracker</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7512</td>
			<td>red mitochondrial marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal inverted microscope SP8-X</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51985026</td>
			<td>serum free medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software v 9.3</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>N/A</td>
			<td>cell imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator UINCU-line IL10</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide StarFrost (3&#8220; x 1&#8220;)&#160;</td>
			<td>Knittel Glass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ORP8&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>134409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-ORP5&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HAP038712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of endogenous intra-organelle protein interactions at er-mitochondria contact sites by proximity ligation assays

Membran temas bölgeleri (MCS'ler), membran füzyonunu içermeden yan yana getirilmiş organeller arasında çeşitli biyomoleküllerin (yani kalsiyum ve lipitler) dinamik değişimine izin veren ve düzenleyen yakın membran yakınlığı alanlarıdır. MCS'ler hücresel homeostaz için gereklidir ve işlevleri, genellikle multimerik protein kompleksleri olarak bulunan yerleşik bileşenler tarafından sağlanır. MCS'ler genellikle lipid sentezi ve hücresel kalsiyum depolamanın önemli bir bölgesi olan endoplazmik retikulumu (ER) içerir ve klasik veziküler taşıma yollarından dışlanan mitokondri gibi organeller için özellikle önemlidir. Son yıllarda, ER ve mitokondri arasındaki MCS'ler, işlevleri hücresel metabolizmayı/biyoenerjetik değerleri güçlü bir şekilde etkilediği için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu temas bölgelerinde membran bağları, kalsiyum kanalları ve lipid transfer proteinleri dahil olmak üzere çeşitli proteinler tanımlanmaya başlanmıştır, bu nedenle bu MCS bileşenlerini incelemek için yeni metodolojilere ve teknik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır. Burada, birbirine fiziksel olarak yakın (>40 nm) olan ve ER-mitokondri MCS'lerinde aynı zarda bulunan proteinlerin saptanmasına izin veren, yakınlık ligasyon testi (PLA), mitokondri boyama ve 3D görüntüleme segmentasyonunu içeren birleşik teknik yaklaşımlardan oluşan bir protokolü açıklıyoruz. Örneğin, daha önce ER-mitokondri ve ER-plazma membranı MCS'lerinde etkileşime girdiği ve lokalize olduğu gösterilen iki ER'ye bağlı lipid transfer proteini, ORP5 ve ORP8 kullandık. ORP5-ORP8 PLA'yı hücre görüntüleme yazılımı analizi ile ilişkilendirerek, ORP5-ORP8 kompleksinin mitokondriyal yüzeyden uzaklığını tahmin etmek ve ORP5-ORP8 PLA etkileşiminin yaklaşık% 50'sinin mitokondriye yakın ER alt alanlarında meydana geldiğini belirlemek mümkün olmuştur.

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, iki ER'ye bağlı lipid transfer proteininin, ORP5 ve ORP8'in etkileşim bölgelerini tespit ettik ve bunların diğer organellerle, özellikle mitokondri ile temas halinde olan ER membran alt alanlarındaki oluşumlarını değerlendirdik. Bunun için, HeLa hücrelerindeki mitokondriyal ağ kırmızı bir mitokondriyal işaretleyici ile boyandı ve özgüllüğü daha önce immünofloresan15 ile test edilen primer antikorlar anti-ORP5 ve anti-ORP8 kull...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays at JoVE.com

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

PLA protokolümüz, membran temas bölgelerindeki proteinler arasındaki endojen etkileşimi tanımlamaya ve ölçmeye izin verir. Endoplazmik retikulum mitokondriyal temas bölgelerinde iki endoplazmik retikulum proteini arasındaki etkileşimi incelemek için kullandık. Bu teknik, PLA'yı organel boyamaları ve organellerin mesafelerinin analizi ile birleştirir.Organeller arası membran temas bölgelerindeki proteinler arasındaki etkileşimde lokalize ve nicelleştirmeye izin verir. Yakınlık ligasyon tahlili veya PLA ve görüntü alma işlemini gerçekleştirdikten sonra, hücre analizi yazılımını MATLAB'ı başlatacak şekilde ayarlayın ve Mac işletim sisteminde Imaris seçeneğini veya Windows'ta düzenleme menüsünü tıklatarak bir uzantı başlatın. Tercihleri seçin, özel araçlar paneline geçin ve yolu ayarlayın.Görüntüleri yazılıma aktarmak için, konfokal yığın görüntülerini doğrudan arena bölümünden veya toplu dönüştürmeye izin veren bağımsız dosya dönüştürücüyü kullanarak bir IMS dosyasına dönüştürün. İçe aktarma işleminden sonra, düzenle'ye tıklayın, görüntü özelliklerine gidin ve görüntü kalibrasyonunu kontrol etmek için görüntü geometrisini seçin. Voksel boyutunun X ve Y'deki gerçek görüntü için beklenen piksel boyutuna ve farklı kanalların kontrastını ayarlamak Z.To Z yığınını oluşturmak için mikroskop tarafından uygulanan adıma karşılık gelip gelmediğini kontrol edin Menüde Düzenle'ye tıklayın, ekran ayarına gidin ve ekran ayarını göster'i seçin.Her rengin görüntüsünü optimize etmek için her kanalı bağımsız olarak ayarlayın. Bu adım, kesin eşikler belirlemek veya zayıf nesneleri tespit etmek için gereklidir. Ardından, görüntüyü kırparak analizi tek bir hücreyle sınırlamak için düzenle'yi tıklayın ve 3D'yi kırp'ı seçin.Aynı görüş alanındaki başka bir hücreyi analiz etmek için, aynı görüntüyü yeniden açın ve farklı şekilde kırpın. ORP5 ve ORP8 etkileşiminin bulunduğu yerde üretilen PLA sinyallerini, yeni bir nesne kümesi oluşturan ve nokta algılama sihirbazını açan yeni noktalar ekle seçeneğine tıklayarak tespit edin. Nokta algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin.Nokta algılama algoritmasının ilgilenilen nesneleri bulmasına yardımcı olmak için tahmini XY çapını ayarlayın. Seçilen değer çok yüksekse, yakındaki nesneler kaynaşır ve değer çok küçükse, anormal sinyaller algılanabilir. Şimdi, ilgilenilen nesnelerin etrafındaki yerel kontrastı artırmak için nokta algılamadan önce görüntü arka planını kaldırmak için arka plan çıkarmaya tıklayın.Kaliteyi yazılım otomatik eşiğinde eşik parametresi olarak tutarak nokta algılama eşiğini ayarlayın veya tüm nesneleri algılamak için bu değeri biraz değiştirin. Nokta algılama bittiğinde, algılama parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için yeniden kullanın. Ardından, yeni bir nesne oluşturmak için yeni yüzeyler ekle'ye tıklayarak bir yüzey oluşturma oluşturmak için mitokondriyal ağı tespit edin ve yüzey algılama sihirbazını açın.Yüzey oluşturma işleminin gerçekleştirileceği kanalı seçin. Daha pürüzsüz bir yüzey elde etmek için pürüzsüz onay kutusunu tıklatarak ve yüzeyde gözlemlenebilen küçük ayrıntıları gösteren bir eşik ayarlayarak Gauss filtresi uygulayın. Ardından, yerel kontrastları geliştirmek için bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin ve sinyalin yoğunluğuna göre mitokondriyal ağı tespit etmek için eşiği ayarlayın.Yüzey sınıflandırma penceresinde voksel sayısı filtresini seçerek eşikten küçük kalıntıları çıkarmak için yüzeye bir filtre uygulayın ve yalnızca ilgilenilen nesneleri tutmak için üst ve alt eşiklerle oynayın. Yüzey oluşturma işlemi bittiğinde, oluşturma parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın. Oluşturulan mitokondriyal yüzeyin dışında bir mesafe haritası oluşturmak için, sahne ağacı kutusunda mitokondri yüzeyini seçin.Görüntü işlemeye tıklayın ve yüzeyler işlevini seçin, ardından mesafe dönüşümü yapın. Kullanıcıdan haritanın nesne yüzeyinin dışında mı yoksa içinde mi hesaplanacağını seçmesini isteyen bir MATLAB uzantısı görünecektir. PLA noktaları ile mitokondri yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için dış yüzey nesnesini seçin.Harita oluşturulduktan sonra, ekran ayarlama panelinde yeni bir kanal olarak görünür. Bu kanalda, her pikselin en yakın mitokondriye olan mesafeye karşılık gelen bir değeri vardır. Her noktadan en yakın mitokondriye olan mesafeyi ölçmek ve en yakın olanları belirlemek ve görselleştirmek için sahne ağacı kutusunda daha önce oluşturulan noktaları seçin.Şimdi, mesafe haritasındaki mitokondriye en yakın mesafeye karşılık gelen her bir nokta merkezinin değerini ölçmek için istatistiklerde ve ayrıntılı günlükte mesafe haritasına karşılık gelen kanalın belirli değerlerini ve merkez yoğunluğunu seçin. Pencerenin sol alt kısmındaki disket simgesine tıklayarak verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın. Mitokondriye olan mesafelerine göre bir nokta alt popülasyonu çıkarmak için, sahne ağacındaki noktaları seçin ve filtreler sekmesine tıklayın.Bu penceredeki mesafe haritasına karşılık gelen kanalın merkez yoğunluğuna göre yeni bir filtre ekleyin ve alt eşiği sıfır mikrometreye ve üst eşiği 0,380 mikrometreye ayarlayarak mitokondriden 380 nanometreden daha az uzaklıktaki noktaları çıkarın. Seçilen noktalara odaklanmak için seçimi yeni noktalara kopyala düğmesine basarak bir çoğaltma adımı gerçekleştirin. Endojen ORP5-ORP8 PLA'nın konfokal görüntüleri, retiküler ER, kortikal ER ve ER alt alanlarındaki HeLa hücrelerinde, genellikle mitokondri ile ilişkili ER membranları olarak adlandırılan mitokondri ile yakın temas halinde etkileşimler gösterdi.3D görüntüleme analizi, endojen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin yaklaşık% 50'sinin mitokondri ile ilişkili ER membranlarında tespit edildiğini ortaya koydu. ORP5 ve ORP8'i birlikte aşırı eksprese eden hücrelerde mitokondri ile ilişkili ER membranlarında meydana gelen ORP5-ORP8 PLA etkileşimlerinin yüzdesi, bu proteinlerin endojen seviyelerde eksprese edildiği hücrelerde gözlemlenene benzerdi. ORP5 ve ORP8 aşağı regülasyonu, toplam PLA sinyali sayısında büyük bir düşüşe neden olurken, birlikte aşırı ekspresyonları PLA'yı artırdı.ORP5-PTPIP51 ve ORP8-PTPIP51 çiftlerinde PLA sinyalleri tespit edildi ve ortalama sayıları ORP5-ORP8 PLA çiftine benzerdi ve ER-mitokondri membran temas bölgelerinde ORP5 ve ORP8 lokalizasyonunu doğruladı. Ayrıca, ORP5-ORP8 PLA'nın mitokondri, ER ve lipid damlacıkları arasındaki üç yönlü bir temas bölgesinde ER plazma membranı temaslarında etkileşimi, PHPLCD-RFP veya mCherry-PLN1 ile transfekte edilmiş HeLa hücreleri kullanılarak tanımlanır. Herhangi bir görüntü analiz yönteminde olduğu gibi, görüntü kalitesi kilit bir noktadır, bu nedenle sinyalin optimizasyonu, nesnelerin otomatik olarak algılanması için belirleyicidir.Bu teknik, üç taraflı ER, mitokondri, lipid damlacıkları temas bölgelerinde ORP5 ve ORP8 fonksiyonu üzerine yaptığımız son çalışmada yaptığımız gibi, iki veya çoklu hücresel organel arasındaki ilişkileri incelemek için de kullanılabilir. Bu teknik, hücre içi iletişim alanındaki diğer çalışmalarda, yeni çok parçalı organeller arası ilişkileri tanımlamak için yardımcı olabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Biyoloji

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptit Diziler protein-protein etkileşim Siteleri belirlenmesi

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...