1.1K Views
•June 9th, 2023
DOI :
June 9th, 2023
•0:06
Introduction
1:04
Preparation for Surgery and Intravital Imaging
2:16
Surgery and Intravital Imaging
7:47
Repetitive Surgery and Intravital Imaging
8:17
Representative Results
9:41
Conclusion
Transcript
Skademodeller er uundværlige for at studere regenerering in vivo, men at undersøge regenerering i tarmen har vist sig at være en teknisk udfordring. Manglen på langsgående billeddannelsesprotokoller har forhindret dybere indsigt i celle- og vævsskaladynamikken, der orkestrerer tarmregenerering. I denne protokol beskriver vi en intravital mikroskopimetode, der lokalt inducerer vævsskade på enkelt kryptskala og følger tarmepitelets regenerative respons i den levende mus på fotonbaseret laserablationsskade af enkeltkrypt eller større tarmfelter på en tids- og rumkontrolleret måde.
Efterfølgende, langsigtet, gentagen intravital billeddannelse muliggør sporing af beskadiget område over tid og giver mulighed for overvågning af kryptdynamik under vævsgendannelse over en periode på flere uger. Inducer mus ved at injicere tamoxifen opløst i solsikkeolie i fire til seks uger før operationen. Påfør analgesi, injicer 200 mikroliter buprenorphin subkutant 30 minutter før operationen.
Administrer carprofen i drikkevand 24 timer før operationen. Indfør autoklaverede sterile kirurgiske værktøjer i biohazard-kabinettet. Tænd varmepuden, og indstil temperaturen til 37 grader Celsius.
Tænd mikroskopets temperaturkontrolkammer mindst fire timer før billeddannelse. Hold temperaturen inde i klimakammeret stabil ved 37 grader Celsius. Tænd for tofotonmikroskopet, scanneren og laseren.
Start billedbehandlingssoftwaren. Indstil laserens bølgelængde til 960 nanometer, og åbn lukkeren. Bedøv musen med to til 3% isofluran, og læg den på en varmepude dækket med en steril klud.
Kontroller dybden af anæstesi ved at vurdere hyppigheden og kvaliteten af vejrtrækning et åndedrag pr. Sekund og ved at kontrollere musens refleks. Dæk musens øjne med øjensalve. Injicer 200 mikroliter forvarmet sterilt saltvand subkutant.
Barber maven og fjern håret. Skift den sterile klud i det kirurgiske område. Indsæt rektal sonde for at overvåge musens temperatur.
Temperaturen skal være ca. 37 grader Celsius. Brug et nyt par sterile handsker. Rengør det kirurgiske område på en cirkulær måde med skiftevis skrubber af antiseptisk opløsning efterfulgt af 80% ethanol tre gange.
Dæk musen med en steril kirurgisk drapering. Kontroller musens refleks. Lav et 10 millimeter lodret midterlinjesnit gennem huden ved hjælp af en steril skalpel.
Skær linea alba ved hjælp af saksen til at adskille rektus mavemuskler og åbne maven. Find musens cecum ved hjælp af en steril vatpind gennemblødt i forvarmet saltvand for at bruge den som referencepunkt. Lav et lille snit i stykke gasbind, våd det i forvarmet sterilt saltvand, og læg det over snittet.
Tag tarmen ud med sterile vatpinde gennemblødt i forvarmet sterilt saltvand. Hold tarmen hydreret ved at tilføje steriliseret forvarmet saltvand. Overfør musen til en forvarmet steril billedbehandlingsboks.
Placer tarmen på det sterile glas. Placer musens hoved inde i billeddannelsesboksens inhalationsrør. Fastgør om nødvendigt musen med steril fleksibel film og tape.
Placer billeddannelsesboksen, der indeholder musen, i mikroskopkammeret. Overvåg musen under billeddannelsen ved at kontrollere hyppigheden og dybden af vejrtrækning og temperatur via en rektal sonde hvert 15. minut. Isofluran bør opbevares mellem en og 2%Find et område i tarmen ved hjælp af mikroskopets IP'er.
Få et bredt feltbillede af interesseområdet ved hjælp af mikroskopets interne kamera. Billede regionen af interesse ved hjælp af 960 nanometer laser af multiphoton mikroskop. Lasereffekten og bølgelængden justeres i henhold til de fluorformer, der anvendes i eksperimentet.
I dette eksempel er krypter udtrykt membran rødt fluorescerende protein og er stokastisk mærket med grønt fluorescerende protein ved induktion med lav ende dosis tamoxifen. Få en 10 til 20 trin Z-stak på tre mikron af interesseområdet. Vælg tidligere en enkelt placering eller flere placeringer fra feltbilledet.
Brug kalibreringsfunktionen til brudpunkt i billedbehandlingssoftwaren med en opløsning på zoom 32 x 124 x 124 pixel med en scanningshastighed på 400 hertz ved hjælp af tovejsscanningsegenskaben i tre til 10 sekunder, afhængigt af størrelsen af den skade, der sigtes mod. Indledningen af skader i kryptområdet kan genkendes ved en stigning i autofluorescens i både den grønne og røde kanal. Efter ablation skal du erhverve Z-stakke af de beskadigede områder for at bekræfte placeringen og omfanget af skaden.
Gentag de to foregående trin for flere områder i den samme mus. Placer musen, mens den stadig er under anæstesi, på et sterilt sutureringsområde og dæk med en steril gardin. Indsæt den udsatte tarm tilbage i maven ved hjælp af sterile vatpinde gennemblødt i forvarmet sterilt saltvand.
Sutur linea alba ved at udføre simpel kontinuerlig sutur ved hjælp af absorberbar sutur. Luk suturens ekstremiteter med kirurgiske knuder. Gentag det samme trin med hudlaget.
Sluk for isofluranstationen, rengør og steriliser billedbehandlingsboksen og indlægget. Lad musen komme sig efter operationen, mens buret placeres på varmepuden i en time. Injicer 200 mikroliter buprenorphin subkutant seks til 12 timer efter operationen.
Administrer carprofen i drikkevand i 72 timer efter operationen. Vej musen og overvåg velfærden hver dag i en uge efter operationen. På det andet tidspunkt mindst en uge efter den første billeddannelsessession gentages operationen og intravital billeddannelse.
Brug mønsteret af blodkar til at finde tilbage de samme områder af interesse billede på det første tidspunkt. Hvis musen ikke er beregnet til at blive afbildet på et andet tidspunkt, skal du ofre musen ved at udføre cervikal dislokation under anæstesi. Ellers fortsæt med lukning af kirurgisk sted og postoperativ pleje.
K19-Cre ERT mTmG-mus blev injiceret med tamoxifen for at fremkalde stokastisk mærkning af celler med GFP fire til seks uger før operationen og første billeddannelsessession. Efter kirurgisk eksponering af musens tarm og erhvervelse af kamera- og fluorescerende billeder af interesseområdet bruges multifotonlaserens brudpunktindstillinger til at ablate krypter. Indledningen af skader kan genkendes ved en stigning i autofluorescens i både den grønne og den røde kanal.
Den samme procedure gentages en måned senere, og vaskulaturen bruges som et vartegn for at finde tilbage den samme region. Ved hjælp af Lgr5-eGFP-konfettimodellen kan krypter mærket med forskellige farver følges over tid for at kortlægge dynamikken i genopretning. I dette eksempel udtrykker krypter i grønt Lgr5 Cre, og en krypt i magenta er mærket med konfettifarve.
Forskellige former for regenerering observeres to uger efter laserablation. Nogle regioner forbliver uændrede, mens andre regioner udviser ombygning i former for kryptfission, så opdelingen af en krypt i to eller fusion, sammensmeltning af to krypter til en eller kryptforsvinden. Laserablation kombineret med intravital mikroskopimetode begrænser skaden til et defineret område af interesse.
Dette gør det muligt for os at kontrollere skadens placering samt skadens omfang. Skadens sværhedsgrad kan moduleres til ablate krypter eller hele tarmfelter for at informere os om det regenerative respons på kryptskalaen. Ud over rumlig kontrol giver laserablation også mulighed for præcist at time begyndelsen af skader ud over at afbilde det samme organ under både homeostatiske og regenererende forhold i den samme mus og derved overgå præcisionen af tidligere skademodeller.
Anvendelsen af laserablation og gentagen intravital billeddannelse kan bruges som en platform for en lang række forskningsspørgsmål og forskellige videnskabelige områder, der spænder over regenerering, immunologi og kræftforskning.
Her præsenterer vi en metode til at få billeder af tarmen ved laserinduceret sår. Ved at udsætte musetarmen for en multifotonlaser induceres tabet af en enkelt eller flere krypter lokalt. Ved gentagne gange at afbilde det beskadigede område over måneder fanges realtidsdynamikken i tarmgendannelse.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved