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•June 9th, 2023
DOI :
June 9th, 2023
•0:06
Introduction
1:04
Preparation for Surgery and Intravital Imaging
2:16
Surgery and Intravital Imaging
7:47
Repetitive Surgery and Intravital Imaging
8:17
Representative Results
9:41
Conclusion
Transcript
विवो में पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए चोट मॉडल अपरिहार्य हैं, हालांकि, आंत में पुनर्जनन की जांच करना एक तकनीकी चुनौती साबित हुई है। अनुदैर्ध्य इमेजिंग प्रोटोकॉल की कमी ने कोशिका और ऊतक पैमाने की गतिशीलता में गहरी अंतर्दृष्टि को रोक दिया है जो आंतों के पुनर्जनन को व्यवस्थित करता है। इस प्रोटोकॉल में, हम एक इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन करते हैं जो स्थानीय रूप से एकल क्रिप्ट पैमाने पर ऊतक क्षति को प्रेरित करता है, और जीवित माउस में आंतों के उपकला की पुनर्योजी प्रतिक्रिया का पालन करता है ताकि समय और स्थान नियंत्रित तरीके से एकल क्रिप्ट या बड़े आंतों के क्षेत्रों के फोटॉन आधारित लेजर एब्लेशन क्षति हो।
इसके बाद, दीर्घकालिक, दोहराए जाने वाले इंट्रावाइटल इमेजिंग समय के साथ क्षतिग्रस्त क्षेत्र की ट्रैकिंग को सक्षम बनाता है, और कई हफ्तों की अवधि में ऊतक वसूली के दौरान क्रिप्ट गतिशीलता की निगरानी के लिए अनुमति देता है। सर्जरी से चार से छह सप्ताह पहले सूरजमुखी के तेल में घुले टैमोक्सीफेन को इंजेक्ट करके चूहों को प्रेरित करें। एनाल्जेसिया लागू करें, सर्जरी से 30 मिनट पहले ब्यूप्रेनोर्फिन के 200 माइक्रोलीटर को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
सर्जरी से 24 घंटे पहले पीने के पानी में कारप्रोफेन का उपयोग करें। बायोहाजार्ड कैबिनेट में आटोक्लेव बाँझ सर्जिकल उपकरण पेश करें। हीटिंग पैड चालू करें, और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
इमेजिंग से कम से कम चार घंटे पहले माइक्रोस्कोप के तापमान नियंत्रण कक्ष को चालू करें। जलवायु कक्ष के अंदर तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखें। दो फोटॉन माइक्रोस्कोप, स्कैनर और लेजर चालू करें।
इमेजिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च करें। लेजर की तरंग दैर्ध्य को 960 नैनोमीटर तक ट्यून करें और शटर खोलें। दो से 3% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें, और इसे बाँझ कपड़े से ढके हीटिंग पैड पर रखें।
प्रति सेकंड एक सांस लेने की आवृत्ति और गुणवत्ता का आकलन करके और माउस के रिफ्लेक्स की जांच करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। माउस की आंखों को आंखों के मलहम के साथ कवर करें। 200 माइक्रोलीटर पूर्व-गर्म बाँझ खारा चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
पेट को शेव करें और बालों को हटा दें। सर्जिकल क्षेत्र में बाँझ कपड़े को बदलें। माउस के तापमान की निगरानी के लिए रेक्टल जांच डालें।
तापमान लगभग 37 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए। बाँझ दस्ताने की एक नई जोड़ी पहनें। सर्जिकल क्षेत्र को एंटीसेप्टिक घोल के वैकल्पिक स्क्रब के साथ एक गोलाकार तरीके से साफ करें, जिसके बाद 80% इथेनॉल को तीन बार साफ करें।
माउस को बाँझ सर्जिकल ड्रेप के साथ कवर करें। माउस के रिफ्लेक्स की जांच करें। बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके त्वचा के माध्यम से 10 मिलीमीटर ऊर्ध्वाधर मध्य रेखा चीरा लगाएं।
रेक्टस पेट की मांसपेशियों को अलग करने और पेट को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करके लिनिया अल्बा को इंजेक्ट करें। इसे संदर्भ बिंदु के रूप में उपयोग करने के लिए पूर्व-गर्म खारा में भिगोए गए बाँझ कपास के फाहे का उपयोग करके माउस के सेकुम का पता लगाएं। धुंध के टुकड़े में एक छोटा सा कट बनाएं, इसे पहले से गर्म बाँझ खारा में गीला करें, और इसे चीरा के ऊपर रखें।
आंत को बाँझ कपास के स्वैब के साथ बाहर निकालें, जो पहले से गर्म बाँझ खारे में भिगोए हुए हैं। स्टरलाइज़्ड प्री-वार्म्ड सलाइन जोड़कर आंत को हाइड्रेटेड रखें। माउस को पहले से गरम बाँझ इमेजिंग बॉक्स में स्थानांतरित करें।
आंत को बाँझ गिलास पर रखें। माउस के सिर को इमेजिंग बॉक्स के इनहेलेशन ट्यूब के अंदर रखें। यदि आवश्यक हो, तो बाँझ लचीली फिल्म और टेप के साथ माउस को सुरक्षित करें।
माइक्रोस्कोप कक्ष में माउस युक्त इमेजिंग बॉक्स रखें। हर 15 मिनट में एक रेक्टल जांच के माध्यम से श्वास की आवृत्ति और गहराई और तापमान की जांच करके इमेजिंग के दौरान माउस की निगरानी करें। आइसोफ्लुरेन को एक से 2% के बीच रखा जाना चाहिए माइक्रोस्कोप के आईपी का उपयोग करके आंत में एक क्षेत्र खोजें।
माइक्रोस्कोप के आंतरिक कैमरे का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र का एक विस्तृत क्षेत्र दृश्य प्राप्त करें। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोप के 960 नैनोमीटर लेजर का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र की छवि। प्रयोग में प्रयुक्त फ्लोरोफॉर्म के अनुसार लेजर शक्ति और तरंग दैर्ध्य को समायोजित करें।
इस उदाहरण में, क्रिप्ट्स व्यक्त झिल्ली लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है, और टैमोक्सीफेन की कम अंत खुराक के साथ प्रेरण पर हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ स्टोकेस्टिक रूप से लेबल किया जाता है। रुचि के क्षेत्र के तीन माइक्रोन का 10 से 20 चरण जेड-स्टैक प्राप्त करें। पहले टाइल छवि से एक एकल स्थिति या कई स्थान चुनें।
इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ज़ूम 32 और 124 बाय 124 पर 124 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन पर ब्रीच पॉइंट कैलिब्रेशन फ़ंक्शन का उपयोग तीन से 10 सेकंड के लिए द्विदिश स्कैनिंग गुण का उपयोग करके स्कैन गति 400 हर्ट्ज के साथ करें, जो नुकसान के आकार पर निर्भर करता है। क्रिप्ट क्षेत्र में क्षति की शुरुआत को हरे और लाल चैनल दोनों में ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि से पहचाना जा सकता है। पृथक्करण के बाद, स्थान और क्षति की सीमा की पुष्टि करने के लिए क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के जेड-स्टैक प्राप्त करें।
एक ही माउस में कई क्षेत्रों के लिए पिछले दो चरणों को दोहराएँ। एक बाँझ ट्यूरिंग क्षेत्र पर एनेस्थीसिया के तहत माउस को रखें और बाँझ ड्रेप के साथ कवर करें। पहले से गर्म बाँझ खारे में भिगोए गए बाँझ कपास के स्वैब का उपयोग करके उजागर आंत को पेट में वापस डालें।
अवशोषित सीवन का उपयोग करके सरल निरंतर सीवन का प्रदर्शन करके लिनिया अल्बा को सीवन करें। सर्जिकल गांठों के साथ सीवन के छोरों को बंद करें। त्वचा की परत के साथ एक ही चरण दोहराएं।
आइसोफ्लुरेन स्टेशन को बंद करें, इमेजिंग बॉक्स को साफ और निष्फल करें और इनले करें। माउस को सर्जरी से ठीक होने दें जबकि पिंजरे को एक घंटे के लिए हीटिंग पैड पर रखा जाता है। सर्जरी के छह से 12 घंटे बाद ब्यूप्रेनोर्फिन के 200 माइक्रोलीटर को इंजेक्ट करें।
सर्जरी के बाद 72 घंटे के लिए पीने के पानी में कारप्रोफेन का उपयोग करें। माउस का वजन करें और सर्जरी के बाद एक सप्ताह के लिए हर दिन कल्याण की निगरानी करें। पहले इमेजिंग सत्र के कम से कम एक सप्ताह बाद दूसरी बार, सर्जरी और इंट्रावाइटल इमेजिंग को दोहराएं।
पहली बार बिंदु पर रुचि छवि के समान क्षेत्रों को वापस खोजने के लिए रक्त वाहिकाओं के पैटर्न का उपयोग करें। यदि माउस को किसी अन्य समय बिंदु पर चित्रित नहीं किया जाना है, तो संज्ञाहरण के तहत ग्रीवा अव्यवस्था करके माउस का त्याग करें। अन्यथा, सर्जिकल साइट और सर्जरी के बाद की देखभाल को बंद करना जारी रखें।
के 19-सीआरई ईआरटी एमटीएमजी चूहों को सर्जरी और पहले इमेजिंग सत्र से चार से छह सप्ताह पहले जीएफपी के साथ कोशिकाओं के स्टोकेस्टिक लेबलिंग को प्रेरित करने के लिए टैमोक्सीफेन के साथ इंजेक्ट किया गया था। शल्य चिकित्सा द्वारा माउस की आंत को उजागर करने और रुचि के क्षेत्र के कैमरा और फ्लोरोसेंट छवियों को प्राप्त करने के बाद, मल्टीफोटॉन लेजर की ब्रीच पॉइंट सेटिंग्स का उपयोग क्रिप्ट्स को हटाने के लिए किया जाता है। क्षति की दीक्षा को हरे और लाल चैनल दोनों में ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि से पहचाना जा सकता है।
एक ही प्रक्रिया को एक महीने बाद दोहराया जाता है, और वास्कुलचर का उपयोग उसी क्षेत्र को वापस खोजने के लिए एक लैंडमार्क के रूप में किया जाता है। Lgr5-eGFP confetti मॉडल का उपयोग करके, पुनर्प्राप्ति की गतिशीलता को मैप करने के लिए समय के साथ विभिन्न रंगों के साथ लेबल किए गए क्रिप्ट का पालन किया जा सकता है। इस उदाहरण में, हरे रंग में क्रिप्ट ्स Lgr5 Cre को व्यक्त कर रहे हैं, और Magenta में एक क्रिप्ट को कॉन्फेट्टी रंग के साथ लेबल किया गया है।
लेजर एब्लेशन के दो सप्ताह बाद पुनर्जनन के विभिन्न तरीके देखे जाते हैं। कुछ क्षेत्र अपरिवर्तित रहते हैं, जबकि अन्य क्षेत्र क्रिप्ट विखंडन के रूपों में रीमॉडेलिंग का प्रदर्शन करते हैं, इसलिए एक क्रिप्ट का विभाजन दो में विभाजित होता है, या संलयन, दो क्रिप्ट को एक में विलय करना, या क्रिप्ट गायब होना। इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी विधि के साथ संयुक्त लेजर एब्लेशन हित के परिभाषित क्षेत्र में क्षति को प्रतिबंधित करता है।
यह हमें क्षति के स्थान के साथ-साथ क्षति की सीमा को नियंत्रित करने में सक्षम बनाता है। क्षति की गंभीरता को क्रिप्ट स्केल पर पुनर्योजी प्रतिक्रिया के बारे में सूचित करने के लिए क्रिप्ट या पूरे आंतों के क्षेत्रों को कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। स्थानिक नियंत्रण के अलावा, लेजर एब्लेशन एक ही माउस में होमियोस्टैटिक और रिजेनरेटिंग दोनों स्थितियों के तहत एक ही अंग की इमेजिंग के अलावा क्षति की शुरुआत को ठीक से समय देने की अनुमति देता है, जिससे पिछले चोट मॉडल की सटीकता को पार किया जा सकता है।
लेजर एब्लेशन और दोहराए जाने वाले इंट्रावाइटल इमेजिंग के आवेदन का उपयोग अनुसंधान प्रश्नों और विविध वैज्ञानिक क्षेत्रों की भीड़ के लिए एक मंच के रूप में किया जा सकता है जो पुनर्जनन, इम्यूनोलॉजी और कैंसर अनुसंधान का विस्तार करते हैं।
यहां, हम लेजर-प्रेरित घाव पर आंत की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। माउस आंत को मल्टीफोटॉन लेजर में उजागर करके, एक एकल या एकाधिक क्रिप्ट (ओं) का नुकसान स्थानीय रूप से प्रेरित होता है। महीनों से क्षतिग्रस्त क्षेत्र को बार-बार इमेजिंग करके, आंतों की वसूली की वास्तविक समय की गतिशीलता को कैप्चर किया जाता है।
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