1.1K Views
•June 9th, 2023
DOI :
June 9th, 2023
•0:06
Introduction
1:04
Preparation for Surgery and Intravital Imaging
2:16
Surgery and Intravital Imaging
7:47
Repetitive Surgery and Intravital Imaging
8:17
Representative Results
9:41
Conclusion
Transcript
Skademodeller er uunnværlige for å studere regenerering in vivo, men det har vist seg å være en teknisk utfordring å undersøke regenerering i tarmen. Mangelen på langsgående avbildningsprotokoller har forhindret dypere innsikt i celle- og vevsskaladynamikken som orkestrerer tarmregenerering. I denne protokollen beskriver vi en intravital mikroskopimetode som lokalt induserer vevsskade på enkeltkryptskala, og følger den regenerative responsen fra tarmepitelet i levende mus til fotonbasert laserablasjonsskade av enkeltkrypt eller større tarmfelt på en tids- og romkontrollert måte.
Etterfølgende, langsiktig, repeterende intravital avbildning muliggjør sporing av skadet område over tid, og muliggjør overvåking av kryptdynamikk under vevgjenoppretting over en periode på flere uker. Indusere mus ved å injisere tamoxifen oppløst i solsikkeolje i fire til seks uker før operasjonen. Påfør analgesi, injiser 200 mikroliter buprenorfin subkutant 30 minutter før operasjonen.
Administrer carprofen i drikkevann 24 timer før operasjonen. Introduser autoklaverte sterile kirurgiske verktøy i biohazard-skapet. Slå på varmeputen, og sett temperaturen på 37 grader Celsius.
Slå på temperaturkontrollkammeret til mikroskopet minst fire timer før avbildning. Hold temperaturen inne i klimakammeret stabil på 37 grader Celsius. Slå på de to fotonmikroskopet, skanneren og laseren.
Start bildebehandlingsprogramvaren. Still inn bølgelengden til laseren til 960 nanometer og åpne lukkeren. Bedøv musen med to til 3% isofluran, og legg den på en varmepute dekket med en steril klut.
Kontroller dybden av anestesi ved å vurdere frekvensen og kvaliteten på pusten ett pust per sekund, og ved å sjekke refleksen til musen. Dekk øynene til musen med øyesalve. Injiser 200 mikroliter forvarmet steril saltoppløsning subkutant.
Barber magen og fjern håret. Bytt den sterile kluten i operasjonsområdet. Sett inn rektal sonde for å overvåke musens temperatur.
Temperaturen skal være omtrent 37 grader Celsius. Bruk et nytt par sterile hansker. Rengjør operasjonsområdet på en sirkulær måte med vekslende skrubber av antiseptisk løsning etterfulgt av 80% etanol tre ganger.
Dekk musen med en steril kirurgisk drapering. Kontroller refleksen til musen. Lag et 10 millimeter vertikalt midtlinjesnitt gjennom huden ved hjelp av en steril skalpell.
Snitt linea alba ved hjelp av saksen for å skille rectus magemusklene og åpne magen. Finn musens cecum ved hjelp av en steril bomullspinne dynket i forvarmet saltvann for å bruke den som referansepunkt. Lag et lite kutt i et stykke gasbind, våt det i forvarmet sterilt saltvann, og legg det over snittet.
Ta ut tarmen med sterile bomullspinner dynket i forvarmet sterilt saltvann. Hold tarmen hydrert ved å tilsette sterilisert forvarmet saltvann. Overfør musen til en forvarmet steril bildeboks.
Plasser tarmen på det sterile glasset. Plasser musens hode inne i innåndingsrøret til bildeboksen. Fest om nødvendig musen med steril, fleksibel film og tape.
Plasser bildeboksen som inneholder musen i mikroskopkammeret. Overvåk musen under avbildningen ved å sjekke frekvensen og dybden av pusten, og temperaturen via en rektal sonde hvert 15. minutt. Isofluran bør holdes mellom en til 2%Finn et område i tarmen ved hjelp av mikroskopets IP-adresser.
Få et bredt feltbilde av interesseområdet ved hjelp av mikroskopets interne kamera. Bilde regionen av interesse ved hjelp av 960 nanometer laser av multifoton mikroskop. Juster lasereffekten og bølgelengden i henhold til fluoroformene som ble brukt i forsøket.
I dette eksemplet er krypter uttrykt membran rødt fluorescerende protein, og er stokastisk merket med grønt fluorescerende protein ved induksjon med lav sluttdose tamoxifen. Skaff deg en 10 til 20 trinns Z-stabel med tre mikron av interesseområdet. Velg en enkelt posisjon eller flere posisjoner fra flisbildet tidligere.
Bruk bruddpunktkalibreringsfunksjonen i bildebehandlingsprogramvaren ved zoom 32 og 124 x 124 pikslers oppløsning med en skannehastighet på 400 hertz ved bruk av toveis skanningsegenskap i tre til 10 sekunder, avhengig av størrelsen på skaden det siktes mot. Initiering av skade i kryptområdet kan gjenkjennes av en økning i autofluorescens i både den grønne og røde kanalen. Etter ablasjon, skaff deg Z-stabler av de skadede områdene for å bekrefte plasseringen og omfanget av skaden.
Gjenta de to foregående trinnene for flere områder i samme mus. Plasser musen mens den fortsatt er under anestesi på et sterilt suturområde og dekk med en steril drapering. Sett den eksponerte tarmen tilbake i magen ved hjelp av sterile bomullspinner dynket i forvarmet sterilt saltvann.
Sutur linea alba ved å utføre enkel kontinuerlig sutur ved hjelp av absorberbar sutur. Lukk ekstremiteter av suturen med kirurgiske knuter. Gjenta det samme trinnet med hudlaget.
Slå av isofluran stasjon, rengjør og steriliser avbildningsboksen og innlegget. La musen komme seg etter operasjonen mens buret er plassert på varmeputen i en time. Injiser 200 mikroliter buprenorfin subkutant seks til 12 timer etter operasjonen.
Administrer carprofen i drikkevann i 72 timer etter operasjonen. Vei musen og overvåk velferden hver dag i en uke etter operasjonen. På det andre tidspunktet minst en uke etter den første bildebehandlingen, gjenta kirurgi og intravital bildebehandling.
Bruk mønsteret av blodkar for å finne tilbake de samme interesseområdene bildet på det første tidspunktet. Hvis musen ikke er ment å bli avbildet på et annet tidspunkt, ofre musen ved å utføre cervikal dislokasjon under anestesi. Ellers fortsetter du med nedleggelse av operasjonsstedet og postoperativ behandling.
K19-Cre ERT mTmG-mus ble injisert med tamoxifen for å indusere stokastisk merking av celler med GFP fire til seks uker før kirurgi og første bildebehandling. Etter kirurgisk eksponering av musens tarm og anskaffelse av kamera og fluorescerende bilder av interesseområdet, brukes bruddpunktinnstillinger for multifotonlaseren til å ablate krypter. Initiering av skade kan gjenkjennes av en økning i autofluorescens i både den grønne og den røde kanalen.
Den samme prosedyren gjentas en måned senere, og vaskulaturen brukes som et landemerke for å finne tilbake til samme region. Ved hjelp av Lgr5-eGFP-konfettimodellen kan krypter merket med forskjellige farger følges over tid for å kartlegge dynamikken i utvinning. I dette eksemplet uttrykker krypter i grønt Lgr5 Cre, og en krypt i magenta er merket med konfettifarge.
Ulike regenereringsmåter observeres to uker etter laserablation. Noen regioner forblir uendret, mens andre regioner viser ombygging i form av kryptfisjon, slik at delingen av en krypt i to, eller fusjon, sammenslåing av to krypter i en, eller kryptforsvinning. Laserablasjon kombinert med intravital mikroskopimetode begrenser skaden til et definert interesseområde.
Dette gjør at vi kan kontrollere skadestedet samt skadeomfanget. Skadealvorlighetsgrad kan moduleres for å ablate krypter eller hele tarmfelt for å informere oss om den regenerative responsen i kryptskalaen. I tillegg til romlig kontroll, tillater laserablasjon også nøyaktig tid på utbruddet av skade i tillegg til avbildning av det samme organet under både homeostatiske og regenererende forhold i samme mus, og overgår dermed presisjonen til tidligere skademodeller.
Anvendelsen av laserablasjon og repeterende intravital avbildning kan brukes som en plattform for en rekke forskningsspørsmål og ulike vitenskapelige områder som spenner over regenerering, immunologi og kreftforskning.
Her presenterer vi en metode for å få bilder av tarmen ved laserindusert sår. Ved å utsette musetarmen for en multifotonlaser, induseres tapet av en enkelt eller flere krypter lokalt. Ved å gjentatte ganger avbilde det skadede området over måneder, fanges sanntidsdynamikken i tarmutvinning.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved