1.1K Views
•June 9th, 2023
DOI :
June 9th, 2023
•0:06
Introduction
1:04
Preparation for Surgery and Intravital Imaging
2:16
Surgery and Intravital Imaging
7:47
Repetitive Surgery and Intravital Imaging
8:17
Representative Results
9:41
Conclusion
Transcript
Skademodeller är oumbärliga för att studera regenerering in vivo, men att undersöka regenerering i tarmen har visat sig vara en teknisk utmaning. Bristen på longitudinella avbildningsprotokoll har förhindrat djupare insikt i cell- och vävnadsskaldynamiken som orkestrerar tarmregenerering. I detta protokoll beskriver vi en intravital mikroskopimetod som lokalt inducerar vävnadsskada i en enda kryptskala och följer det regenerativa svaret från tarmepitelet i den levande musen på fotonbaserad laserablationsskada av enstaka krypta eller större tarmfält på ett tids- och rumskontrollerat sätt.
Efterföljande, långsiktig, repetitiv intravital avbildning möjliggör spårning av skadat område över tid och möjliggör övervakning av kryptdynamik under vävnadsåtervinning under en period av flera veckor. Inducera möss genom att injicera tamoxifen upplöst i solrosolja i fyra till sex veckor före operationen. Applicera analgesi, injicera 200 mikroliter buprenorfin subkutant 30 minuter före operationen.
Administrera karprofen i dricksvatten 24 timmar före operationen. Introducera autoklaverade sterila kirurgiska verktyg i biohazardskåpet. Slå på värmedynan och ställ in temperaturen på 37 grader Celsius.
Slå på mikroskopets temperaturkontrollkammare minst fyra timmar före avbildning. Håll temperaturen inne i klimatkammaren stabil på 37 grader Celsius. Slå på de två fotonmikroskopen, skannern och lasern.
Starta bildprogramvaran. Ställ in laserns våglängd till 960 nanometer och öppna slutaren. Bedöva musen med två till 3% isofluran och placera den på en värmedyna täckt med en steril trasa.
Kontrollera anestesidjupet genom att bedöma frekvensen och kvaliteten på andningen ett andetag per sekund och genom att kontrollera musens reflex. Täck musens ögon med ögonsalva. Injicera 200 mikroliter förvärmd steril saltlösning subkutant.
Raka buken och ta bort håret. Byt den sterila duken i operationsområdet. Sätt i rektal sond för att övervaka musens temperatur.
Temperaturen bör vara ungefär 37 grader Celsius. Använd ett nytt par sterila handskar. Rengör det kirurgiska området på ett cirkulärt sätt med alternerande skrubb av antiseptisk lösning följt av 80% etanol tre gånger.
Täck musen med ett sterilt kirurgiskt draperi. Kontrollera musens reflex. Gör ett 10 millimeter vertikalt snitt genom huden med en steril skalpell.
Klipp linea alba med saxen för att separera rektusmagmusklerna och öppna buken. Hitta musens cecum med en steril bomullspinne dränkt i förvärmd saltlösning för att använda den som referenspunkt. Gör ett litet snitt i bit av gasväv, våt den i förvärmd steril saltlösning och placera den ovanför snittet.
Ta ut tarmen med sterila bomullspinnar dränkta i förvärmd steril saltlösning. Håll tarmen hydratiserad genom att tillsätta steriliserad förvärmd saltlösning. Överför musen till en förvärmd steril bildbox.
Placera tarmen på det sterila glaset. Placera musens huvud inuti inandningsröret i bildboxen. Säkra musen vid behov med steril flexibel film och tejp.
Placera bildboxen som innehåller musen i mikroskopkammaren. Övervaka musen under avbildningen genom att kontrollera andningsfrekvens och andningsdjup och temperatur via en rektal sond var 15: e minut. Isofluran bör hållas mellan en till 2%Hitta en region i tarmen med hjälp av mikroskopets IP.
Få en bred fältvy av området av intresse med hjälp av mikroskopets interna kamera. Föreställ dig området av intresse med hjälp av 960 nanometer laser av multifotonmikroskop. Justera lasereffekten och våglängden enligt fluoroformerna som används i experimentet.
I detta exempel är krypter uttryckt membran rött fluorescerande protein och är stokastiskt märkta med grönt fluorescerande protein vid induktion med låg slutdos av tamoxifen. Skaffa en 10 till 20 steg Z-stack av tre mikron av regionen av intresse. Välj en enda position eller flera positioner från panelbilden tidigare.
Använd brytpunktskalibreringsfunktionen i bildåtergivningsprogrammet vid zoom 32 och 124 x 124 pixlars upplösning med en skanningshastighet på 400 hertz med hjälp av den dubbelriktade skanningsegenskapen i tre till 10 sekunder, beroende på skadans storlek. Initieringen av skador i kryptområdet kan erkännas av en ökning av autofluorescens i både den gröna och röda kanalen. Efter ablation, skaffa Z-staplar av de skadade områdena för att bekräfta platsen och omfattningen av skadan.
Upprepa föregående två steg för flera regioner i samma mus. Placera musen medan den fortfarande är under anestesi på ett sterilt sutureringsområde och täck med ett sterilt draperi. Sätt in den exponerade tarmen tillbaka i buken med sterila bomullspinnar dränkta i förvärmd steril saltlösning.
Suturera linea alba genom att utföra enkel kontinuerlig sutur med absorberbar sutur. Stäng suturens extremiteter med kirurgiska knutar. Upprepa samma steg med hudskiktet.
Stäng av isofluranstationen, rengör och sterilisera bildboxen och inlägget. Låt musen återhämta sig från operationen medan buret placeras på värmedynan i en timme. Injicera 200 mikroliter buprenorfin subkutant sex till 12 timmar efter operationen.
Administrera karprofen i dricksvatten i 72 timmar efter operationen. Väg musen och övervaka välbefinnandet varje dag i en vecka efter operationen. På den andra tidpunkten minst en vecka efter den första bildsessionen, upprepa kirurgi och intravital bildbehandling.
Använd mönstret av blodkärl för att hitta tillbaka samma regioner av intresse bild på den första tidpunkten. Om musen inte är avsedd att avbildas vid en annan tidpunkt, offra musen genom att utföra cervikal dislokation under anestesi. Annars fortsätter du med stängning av operationsområdet och vård efter operationen.
K19-Cre ERT mTmG-möss injicerades med tamoxifen för att inducera stokastisk märkning av celler med GFP fyra till sex veckor före operation och första bildsession. Efter kirurgisk exponering av musens tarm och förvärv av kamera- och fluorescerande bilder av området av intresse används brytpunktsinställningar för multifotonlasern för att ablatera krypter. Initieringen av skador kan erkännas av en ökning av autofluorescens i både den gröna och den röda kanalen.
Samma procedur upprepas en månad senare, och vaskulaturen används som ett landmärke för att hitta tillbaka samma region. Med hjälp av Lgr5-eGFP-konfettimodellen kan krypter märkta med olika färger följas över tid för att kartlägga återhämtningsdynamiken. I det här exemplet uttrycker krypter i grönt Lgr5 Cre, och en krypta i magenta är märkt med konfettifärg.
Olika regenereringssätt observeras två veckor efter laserablation. Vissa regioner förblir oförändrade, medan andra regioner uppvisar ombyggnad i form av kryptklyvning, så uppdelningen av en krypta i två, eller fusion, sammanslagning av två krypter till en, eller kryptförsvinnande. Laserablation i kombination med intravital mikroskopimetod begränsar skadan till ett definierat område av intresse.
Detta gör det möjligt för oss att kontrollera platsen för skadan samt skadans omfattning. Skadornas svårighetsgrad kan moduleras för att ablatera krypter eller hela tarmfält för att informera oss om det regenerativa svaret på kryptskalan. Förutom rumslig kontroll tillåter laserablation också att exakt tajma uppkomsten av skador förutom att avbilda samma organ under både homeostatiska och regenererande förhållanden i samma mus och därigenom överträffa precisionen hos tidigare skademodeller.
Tillämpningen av laserablation och repetitiv intravital avbildning kan användas som en plattform för en mängd forskningsfrågor och olika vetenskapliga områden som spänner över regenerering, immunologi och cancerforskning.
Här presenterar vi en metod för att få bilder av tarmen vid laserinducerad sårbildning. Genom att exponera mustarmen för en multifotonlaser induceras förlusten av en enda eller flera kryptor lokalt. Genom att upprepade gånger avbilda det skadade området under månader fångas realtidsdynamiken i tarmåterhämtningen.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved