Name: mouse in vivo placental targeted crispr manipulation
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation at JoVE.com

Forfatterne anerkender følgende finansieringskilder: R01 MH122435, NIH T32GM008629 og NIH T32GM145441. Forfatterne takker Dr. Val Sheffield og Dr. Calvin Carters laboratorier ved University of Iowa for brugen af deres operationsrum og udstyr samt Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan og Dr. Matthew Weber for deres hjælp med mikroskopi. Forfatterne takker også Dr. Sara Maurer, Maya Evans og Sreelekha Kundu for deres hjælp med pilotoperationerne.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med og overholdelse af føderale regler og University of Iowa politik og blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dyr og husdyrhold
<ol><li>Hold dyrene i en 12 timers dagslyscyklus med mad og vand ad libitum.</li>
	<li>Brug CD-1 hunmus i alderen 8-15 uger. Brug tilstedeværelsen af et kopulatorisk stik til at identificere E0.5.</li>
	<li>På E0.5 skal du enkeltvis huse de gravide dæmninger.</li...

<ol>
	<li>Cross, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).</li><li>Perez-Garcia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placentation+defects+are+highly+prevalent+in+embryonic+lethal+mouse+mutants.">Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants.</a> Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta-brain-axis.">The placenta-brain-axis.</a> Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).</li><li>Maslen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+placenta-heart+interactions.">Recent advances in placenta-heart interactions.</a> Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).</li><li>Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+horizons+for+neurodevelopmental+disorders:+Placental+mechanisms.">Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms.</a> Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).</li><li>Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+placental+development+and+its+impact+on+fetal+growth-new+insights+from+mouse+models.">Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).</li><li>Goeden, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Inflammation+disrupts+fetal+neurodevelopment+via+increased+placental+output+of+serotonin+to+the+fetal+brain.">Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain.</a> Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).</li><li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease.">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li><li>Wilson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+commonly+expressed+genes+between+first+trimester+fetal+heart+and+placenta+cell+types+in+the+context+of+congenital+heart+disease.">Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).</li><li>Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Genetic+manipulation+of+the+rodent+placenta.">Review: Genetic manipulation of the rodent placenta.</a> Placenta. 32, S130-S135 (2011).</li><li>Wenzel, P. L., Leone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cre+recombinase+in+early+diploid+trophoblast+cells+of+the+mouse+placenta.">Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta.</a> Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).</li><li>Zhou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+placental-specific+DNA+recombination+in+transgenic+mice.">Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice.</a> PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).</li><li>Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+promoter-directed+expression+of+cre+recombinase+in+mouse+placenta.">The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta.</a> Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).</li><li>Nadeau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map2k1+and+Map2k2+genes+contribute+to+the+normal+development+of+syncytiotrophoblasts+during+placentation.">Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation.</a> Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).</li><li>Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+trophoblast-specific+genetic+manipulation+using+lentiviral+delivery.">Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery.</a> BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).</li><li>Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+placental+defects+and+embryonic+lethality+by+trophoblast-specific+lentiviral+gene+transfer.">Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer.</a> Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).</li><li>Lecuyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+placental+marker+of+fetal+brain+defects+after+in+utero+alcohol+exposure.">a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).</li><li>Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+placental+gene+transfer+of+IGF-1+corrects+placental+insufficiency+via+enhanced+placental+glucose+transport+mechanisms.">Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms.</a> PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).</li><li>Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+transporters+by+adenoviral-mediated+human+insulin-like+growth+factor-1+in+a+mouse+model+of+placental+insufficiency+in+vivo+and+the+human+trophoblast+line+BeWo+in+vitro.">Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro.</a> Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).</li><li>Song, A. J., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+avoiding+problems+when+using+the+Cre-lox+system.">Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system.</a> Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).</li><li>Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+of+adenoviral+vectors.">Biosafety of adenoviral vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+Lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: Lessons from mouse mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Elmore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+atlas+of+the+developing+mouse+placenta.">Histology atlas of the developing mouse placenta.</a> Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).</li><li>Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+phenotype+and+the+insulin-like+growth+factors:+Resource+allocation+to+fetal+growth.">Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth.</a> The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).</li><li>Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factors+in+embryonic+and+fetal+growth+and+skeletal+development+(Review).">Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review).</a> Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).</li><li>Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear+by+in+vivo+electroporation.">Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).</li><li>Elser, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+maternal+exposure+to+cypermethrin+and+stress+affect+embryonic+brain+and+placental+outcomes+in+mice.">Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice.</a> Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).</li><li>Gumusoglu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+maternal+interleukin-17+and+autism-related+cortical+gene+expression,+neurobiology,+and+behavior.">Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior.</a> Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).</li><li>Liu, F., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+gene+transfer+to+the+liver+following+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).</li><li>Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+via+sonoporation+and+electroporation.">Introduction of genes via sonoporation and electroporation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+gene+editing+using+ribonucleoproteins+in+skin+stem+cells+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+mouse+model.">Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).</li><li>Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).</li><li>Bond, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+and+coordination+of+neurogenesis+and+astrogenesis+in+developing+mouse+hippocampal+subregions.">Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions.</a> Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).</li><li>Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+developmental+events+in+the+early+mouse+embryo.">Timing of developmental events in the early mouse embryo.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).</li><li>Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+trophoblast+cells+and+trophoblast+invasion+assay.">Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+efficiently+induces+specific+and+reversible+gene+silencing+in+human+iPSCs.">CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Dai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+CRISPRa+screen+identifies+putative+enhancers.">Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers.</a> Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).</li><li>Ursini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+genomic+risk+scores+and+early+neurodevelopmental+outcomes.">Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).</li><li>Smajdor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+fetal+surgery.">Ethical challenges in fetal surgery.</a> Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).</li><li>Antiel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+the+new+world+of+maternal-fetal+surgery.">Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery.</a> Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).</li></ol>

Placenta er en primær regulator af fostrets vækst, og som tidligere nævnt kan ændringer i placenta genekspression eller funktion påvirke fostrets udviklingbetydeligt 6. Den her skitserede protokol kan bruges til at udføre en målrettet in vivo CRISPR-manipulation af musemoderkagen ved hjælp af en relativt avanceret kirurgisk tilgang. Denne teknik giver mulighed for et betydeligt udbytte af levedygtige embryoner og deres tilsvarende placentas, der kan bruges til yderligere undersøg...

Placenta er et vigtigt organ involveret i fostrets udvikling. Placentas hovedrolle er at tilvejebringe væsentlige faktorer og regulere overførslen af næringsstoffer og affald til og fra fosteret. Pattedyrs placentas består af både føtal og modervæv, som udgør foster-moderens grænseflade, og dermed genetikken hos både moderen og fosteret påvirker funktion1. Genetiske anomalier eller nedsat funktion af moderkagen kan drastisk ændre fostrets udvikling. Tidligere arbejde har vist, at placenta genetik og udvikling er forbundet med den ændrede udvikling af specifikke organsystemer hos fosteret. Især er abnormiteter i moderkagen forbundet med ændringer i fostrets hjerne, hjerte og vaskulære system 2,3,4,5.
Transporten af hormoner, vækstfaktorer og andre molekyler fra moderkagen til fosteret spiller en stor rolle i fostrets udvikling6. Det har vist sig, at ændring af placentaproduktionen af specifikke molekyler kan ændre neuroudvikling. Moderens inflammation kan øge produktionen af serotonin ved at ændre tryptophan (TRP) metabolisk genekspression i moderkagen, hvilket efterfølgende skaber en ophobning af serotonin i fostrets hjerne7. Andre undersøgelser har fundet placentaabnormiteter sammen med hjertefejl. Abnormiteter i moderkagen menes at bidrage til medfødte hjertefejl, den mest almindelige fødselsdefekt hos mennesker8. En nylig undersøgelse har identificeret flere gener, der har lignende cellulære veje i både moderkagen og hjertet. Hvis de forstyrres, kan disse veje forårsage defekter i begge organer9. Defekterne i moderkagen kan forværre medfødte hjertefejl. Placentagenetikkens og funktionens rolle på udviklingen af det specifikke føtale organsystem er et voksende fagområde.
Mus har hæmokorial placentas og andre træk ved menneskelige placentas, hvilket gør dem meget nyttige modeller til undersøgelse af menneskelig sygdom1. På trods af moderkagens betydning mangler der i øjeblikket målrettede in vivo-genetiske manipulationer. Desuden er der i øjeblikket flere muligheder for knockouts eller knockdowns end overekspression eller gain-of-function manipulationer i moderkagen10. Der er flere transgene Cre-ekspressive linjer til placenta-specifik manipulation, hver i forskellige trofoblastlinjer på forskellige tidspunkter. Disse omfatter Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER og Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mens disse Cre-transgener er effektive, er de muligvis ikke i stand til at manipulere nogle gener på bestemte tidspunkter. En anden almindeligt anvendt metode til enten knockout eller overexpress placenta-genekspression er indsættelse af lentivirale vektorer i blastocystkultur, hvilket forårsager en trofoblastspecifik genetisk manipulation15,16. Denne teknik giver mulighed for en robust ændring i placentagenekspressionen tidligt i udviklingen. Anvendelsen af RNA-interferens in vivo er blevet sparsomt udnyttet i moderkagen. Indsættelsen af shRNA-plasmider kan udføres på samme måde som CRIPSR-teknikken beskrevet i dette papir. Dette er blevet gjort ved E13.5 for med succes at reducere PlGF-ekspression i moderkagen, med indvirkning på afkom hjernevaskulatur17.
Ud over teknikker, der primært anvendes til knockout eller knockdown, udføres inducerende overekspression almindeligvis med adenovirus eller indsættelse af et eksogent protein. De teknikker, der anvendes til overekspression, har varierende succesrater og er for det meste blevet udført senere i drægtigheden. For at undersøge rollen som insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF-1) i placentafunktionen blev der udført en adenoviralmedieret placentagenoverførsel for at inducere overekspression af IGF-1-genet 18,19. Dette blev udført sent i musedrægtigheden på E18.5 via direkte placentainjektion. For at give yderligere muligheder og omgå mulige fejl i etablerede placentagenetiske manipulationer, såsom Cre-Lox-kombinationsfejl, adenovirusets mulige toksicitet og shRNA's off-target-virkninger, kan in vivo direkte CRISPR-manipulation af moderkagen anvendes20,21,22. Denne model blev udviklet for at afhjælpe manglen på overekspressionsmodeller og for at skabe en model med fleksibilitet.
Denne teknik er baseret på Lecuyer et al.'s arbejde, hvor shRNA- og CRISPR-plasmider blev målrettet direkte in vivo til museplacentas for at ændre PlGF-ekspression 17. Denne teknik kan bruges til direkte at ændre placentagenekspression ved hjælp af CRISPR-manipulation på flere tidspunkter; til dette arbejde blev E12.5 valgt. Placenta er modnet på dette tidspunkt og er stor nok til at manipulere, hvilket muliggør indsættelse af et specifikt CRISPR-plasmid på E12.5, hvilket kan have en betydelig indvirkning på fostrets udvikling fra midten til sen graviditet23,24. I modsætning til transgene tilgange, men ligner virale induktioner eller RNA-interferens, tillader denne teknik overekspression eller knockout på bestemte tidspunkter ved hjælp af en relativt avanceret kirurgisk tilgang, hvorved mulig nedsat placentation eller embryonal dødelighed fra tidligere ændringer undgås. Da kun få placentas modtager eksperimentel eller kontrolplasmidet i et kuld, giver tilgangen mulighed for to typer interne kontroller. Disse kontroller er dem, der injiceres og elektroporeres med det passende kontrolplasmid, og dem, der ikke modtager nogen direkte manipulation. Denne teknik blev optimeret til at skabe en overekspression af IGF-1 genet i museplacenta via en synergistisk aktiveringsmediator (SAM) CRISPR plasmid. IGF-1 genet blev valgt, da IGF-1 er et essentielt væksthormon leveret til fosteret, der primært produceres i moderkagen før fødslen25,26. Denne nye placenta-målrettede CRISPR-teknik giver mulighed for direkte manipulation for at hjælpe med at definere forbindelsen mellem placenta funktion og fosterudvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml Tubes</td>
			<td >USA Scientific Inc</td>
			<td >1615-5500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >J61899.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well plate</td>
			<td >Cornings</td>
			<td >3598</td>
			<td>For BCA kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Absorbent Underpads</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Activation Control Plasmid</td>
			<td >Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-437275</td>
			<td>Dnase-free water provided for dilution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMV Reverse Transcriptase</td>
			<td >New England Biolabs</td>
			<td >M0277L</td>
			<td>Use for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthetic Gas Vaporizor</td>
			<td>Vetamac</td>
			<td >VAD-601TT</td>
			<td>VAD-compact vaporizer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Artifical Tear Gel</td>
			<td >Akorn</td>
			<td >NDC 59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biovortexer</td>
			<td >Bellco Glass, Inc.</td>
			<td >198050000</td>
			<td>Hand-held tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellSens Software</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >V4.1.1</td>
			<td>Image processing to FISH images.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge 5810</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >EP022628168</td>
			<td>Plate centrifuge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >J67241-AP</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton Tipped Applicators</td>
			<td >ProAdvantage</td>
			<td >77100</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CRISPR/Cas9 Control Plasmid</td>
			<td >Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-418922</td>
			<td>Dnase-free water provided for dilution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CryoStat</td>
			<td >Leica</td>
			<td >CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection Microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M125 C</td>
			<td>Used for post-necroscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissolvable Sutures</td>
			<td >Med Vet International</td>
			<td >J385H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Distilled Water</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td >Thermo fisher Scientific</td>
			<td >14190144</td>
			<td>(-) Calcium; (-) Magnesium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0662</td>
			<td>Generator only</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Electric Razor</td>
			<td >Wahl</td>
			<td >CL9990</td>
			<td>Kent Scientific</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Electroporation paddles/Tweezertrodes</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0487</td>
			<td>3 mm diameter paddles; wires included</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Embedding Cassette: 250 PK</td>
			<td >Grainger</td>
			<td >21RK94</td>
			<td>Placenta embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >268280010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-Air Canisters</td>
			<td >Penn Veterinary Supply Inc</td>
			<td >BIC80120</td>
			<td>Excess isoflurane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fast Green Dye FCF</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F7252-5G</td>
			<td>Dissolve to 1 &#956;g/ml and filter; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter-based microplate photometer (plate reader)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >14377576</td>
			<td>Can be used for BCA and ELISA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >VWR</td>
			<td >82027-386</td>
			<td>Fine tips, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >B150-86-10</td>
			<td>O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >1861281</td>
			<td>Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating Pad</td>
			<td >Thermotech</td>
			<td >S766D</td>
			<td>Digitial Moist Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemostats</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10806-188</td>
			<td>Fully surrated jaw; curved</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hot Water Bath</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >20253</td>
			<td>Isotemp 205</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Igf-1 SAM Plasmid (m1)</td>
			<td >Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-421056-ACT</td>
			<td>Dnase-free water provided for dilution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Induction Chamber</td>
			<td >Vetamac</td>
			<td >941443</td>
			<td>No specific liter size required</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Piramal Pharma Limited</td>
			<td >NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoproponal/2-Proponal</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A451-4</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine HCl 100mg/ml</td>
			<td >Akorn</td>
			<td >NDC 59399-114-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2/Magneisum Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >63069-100ML</td>
			<td>1M. Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroAmp&#8482; Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4309849</td>
			<td>Barcoded plates not required</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcapillary Tip</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5196082001</td>
			<td>Attached to BTX Microinjector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjector</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0766</td>
			<td>Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microject 1000A (Injection Machine)</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0751</td>
			<td>MicroJect 1000A Plus System</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >P-97</td>
			<td>Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate Mixer (Plate Shaker)</td>
			<td >scilogex</td>
			<td >822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td >R &#38; D Systems</td>
			<td >MG100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles</td>
			<td >BD - Becton, Dickson, and Company</td>
			<td >305106</td>
			<td>30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nitrogen Tank</td>
			<td >Linde</td>
			<td >7727-37-9</td>
			<td>Any innert gas</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)</td>
			<td >Norbrook Laboratories Limited</td>
			<td >NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analesgic such as Meloxicam</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nose Cone</td>
			<td >Vetamac</td>
			<td >921609</td>
			<td>9-14 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opal 620 detection dye</td>
			<td >Akoya Biosciences</td>
			<td >SKU FP1495001KT</td>
			<td>Used for FISH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen Tank</td>
			<td >Linde</td>
			<td >7782 - 44 - 7</td>
			<td>Medical grade oxygen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pestles</td>
			<td >USA Scientific Inc</td>
			<td >14155390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine Solution, 5%</td>
			<td >Avrio Health L.P.</td>
			<td >NDC 67618-155-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Power SYBR&#8482; Green PCR Master Mix</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >4367659</td>
			<td>Use for qPCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random Hexamers (Random Primers)</td>
			<td >New England Biolabs</td>
			<td >S1330S</td>
			<td>Use for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Razor Blade</td>
			<td >Grainger</td>
			<td >26X080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA Cleanup Kit &#38; Concentrator</td>
			<td >Zymo Research</td>
			<td >R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNALater</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAscope kit v.2.5</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >323100</td>
			<td >Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAscope&#8482; Probe- Mm-Prl8a8-C2</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >&#160;528641-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAscope&#8482; Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >527421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roto-Therm Mini</td>
			<td >Benchmark</td>
			<td >R2020</td>
			<td>Dry oven for in situ hybridization</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scissors</td>
			<td >VWR</td>
			<td >82027-578</td>
			<td>Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#185;/&#8322;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride (Saline)</td>
			<td >Hospra</td>
			<td >NDC 0409-4888-03</td>
			<td>Sterile,&#160; 0.9%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]</td>
			<td >Research Product International</td>
			<td >03-04-6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >SS277</td>
			<td>Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steamer</td>
			<td >Bella</td>
			<td >B00DPX8UBA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Surgical Drape</td>
			<td >Busse</td>
			<td >696</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgipath Cover Glass 24x60</td>
			<td >Leica</td>
			<td >3800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes</td>
			<td >BD - Becton, Dickson, and Company</td>
			<td >309659</td>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Invitrogen&#8482; Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer with WiFi and Qubit&#8482; 4 Fluorometer</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-400-525</td>
			<td>This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.&#160; Qubit quantification not required.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue Adhesive</td>
			<td >3M</td>
			<td >1469SB</td>
			<td>VetBond</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris HCl</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15568025</td>
			<td>1M. Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol&#8482; Reagent</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TSA Buffer Pack</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >322810</td>
			<td>Used to dilute Opal 620 detection dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Universal F-Circuit</td>
			<td >Vetamac</td>
			<td >40200</td>
			<td>Attached to vaporizer and vaporizer accessories</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Upright Compound Fluorescence Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >BX61VS</td>
			<td>Used for FISH imaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vectorshield with DAPI</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >H-1200</td>
			<td>Coverslip mounting media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ViiA&#8482; 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >4453536</td>
			<td>This is for SYBR 384-well block detection.&#160; TaqMan and/or smaller blocks available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >C450B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine 20mg/ml</td>
			<td >Anased</td>
			<td >343730_RX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse in vivo placental targeted crispr manipulation

Placenta er et vigtigt organ, der regulerer og opretholder pattedyrs udvikling i livmoderen. Placenta er ansvarlig for overførsel af næringsstoffer og affald mellem moderen og fosteret og produktion og levering af vækstfaktorer og hormoner. Placentagenetiske manipulationer hos mus er afgørende for at forstå moderkagens specifikke rolle i prænatal udvikling. Placenta-specifikke Cre-ekspressive transgene mus har varierende effektivitet, og andre metoder til placenta genmanipulation kan være nyttige alternativer. Dette papir beskriver en teknik til direkte at ændre placenta genekspression ved hjælp af CRISPR-genmanipulation, som kan bruges til at ændre ekspressionen af målrettede gener. Ved hjælp af en relativt avanceret kirurgisk tilgang gennemgår gravide mødre en laparotomi på embryonal dag 12.5 (E12.5), og et CRISPR-plasmid leveres af en glasmikropipette ind i de enkelte moderkager. Plasmidet elektroporeres straks efter hver injektion. Efter dæmningsgenopretning kan moderkagerne og embryonerne fortsætte udviklingen indtil vurdering på et senere tidspunkt. Evalueringen af moderkagen og afkom efter brug af denne teknik kan bestemme rollen som tidsspecifik placenta funktion i udvikling. Denne type manipulation vil give mulighed for en bedre forståelse af, hvordan placenta genetik og funktion påvirker fostrets vækst og udvikling i flere sygdomssammenhænge.

Generelle procedureresultater (figur 6) I undersøgelsen var der tre manipulerede grupper. Disse omfattede placentas injiceret med et generelt CRISPR Cas9 kontrolplasmid (Cas9 Control), et aktiveringskontrol CRISPR-plasmid (Act Control) eller et IGF-1 SAM-aktiveringsplasmid (Igf1-OE). Cas9 Control er bedre egnet til knockout-plasmider, og aktiveringskontrollen er bedre egnet til overekspression/aktiveringsplasmider. For at vurdere levedygtigheds?...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation at JoVE.com

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Her beskriver vi en tidsspecifik metode til effektivt at manipulere kritiske udviklingsveje i musemoderkagen in vivo. Dette udføres ved injektion og elektroporation af CRISPR-plasmider i moderkagen hos gravide mødre på embryonal dag 12.5.

Mus In vivo placenta målrettet CRISPR-manipulation

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Denne protokol er vigtig, da den giver mulighed for tidsspecifik målrettet manipulation af museplacentas ved hjælp af CRISPR. Dette vil gøre det muligt for forskere at belyse specifikke genfunktioner i midten til slutningen af graviditeten. Genetiske manipulationer, der forårsager overekspression i moderkagen hos musen, er meget ualmindelige.Den største fordel ved denne teknik er, at den giver mulighed for en række genekspressionsændringer i moderkagen. Bliv ikke modløs, hvis foreløbige vilkår har denne teknik mislykket. Da denne teknik er udfordrende, kræver det en hel del tid at øve sig på at mestre.Til at begynde med skal du placere den bedøvede dæmning liggende med en næsekegle for at opretholde anæstesi i forberedelsesområdet. Barber dæmningens underliv grundigt. For at forhindre hornhindetørring skal du placere kunstig tåregel over begge dæmningens øjne.Brug derefter sterile applikatorer med bomuldsspids til at desinficere det kirurgiske sted med mindst tre vekslende runder af en povidon-jodopløsning efterfulgt af 70% ethanol med et sidste lag povidon-jodopløsning. Efter forberedelse skal du flytte dæmningen med anæstesinæsekeglen til det udpegede operationsområde. Til livmoderens laparotomi skal du placere dæmningen liggende på operationsbordet og fastgøre næsekeglen på plads med tape.Placer en varmepude under en absorberende pude indstillet til 45 grader Celsius. Efter at have bekræftet anæstesidybden via manglende tåklemmerefluks, skal du bruge tang og saks til at lave et omtrentligt to centimeter midterlinjesnit gennem telthuden. Lav derefter et lodret snit gennem peritoneum ved hjælp af sterile tang, forsigtigt teltet væk fra livmoderhornene.Massage begge livmoderhorn ved at trykke på hver side af maven med fingrene for at guide dem. Placer den udsatte livmoder oven på sterile kirurgiske gardiner placeret over underlivet og hold den fugtig med dråber varmt sterilt saltvand efter behov. Når livmoderen er udsat, skal du vælge tre par moderkager til manipulation.Optag placeringen af placenta manipulationer og organiseringen af embryonerne i livmoderhornene. Til placentainjektion af kontrolplasmidet fyldes en tilstrækkelig mængde af det relevante kontrolplasmid til tre injektioner med en kalibreret mikropipette. Udfør alle injektioner mellem decidua og forbindelseszonen i en dybde på ca. 0,5 millimeter lateralt ind i moderkagen.Efter injektion, men umiddelbart før elektroporation, skal du belægge kontaktstederne med sterilt saltvand og påføre saltvand præcist på de tre steder på livmodervæggen og padlerne med en dråber eller sprøjte. Inden for to minutter efter injektion udføres elektroporation ved hjælp af et par tre millimeter padler fastgjort til en elektroporationsmaskine. For at sikre CRISPR-inkorporeringseffektivitet og embryoners levedygtighed skal du justere indstillingerne til 30 volt, 30 millisekunders puls, to impulser, 970 millisekunders puls slukket og unipolær.Tryk forsigtigt elektroporationspadlerne over livmodervæggene på moderkagens laterale sider. Placer anodepadlen over injektionsstedet og katoden lige overfor. Tryk på pulsen på elektroporationsmaskinen, og vent på, at de to impulser er færdige, før du fjerner elektroporationspadlerne.Fortsæt derefter til placenta injektion af det eksperimentelle plasmid som vist tidligere. Udfør elektroporation af alle tre eksperimentelle injicerede placentas inden for to minutter efter injektionen som udført for kontrolgruppen. Når placenta manipulation er afsluttet, skal du forsigtigt massere livmoderhornene tilbage inde i bughulen ved kun at bruge fingrene til direkte at manipulere livmoderhornene.Udfør afbrudte suturer på peritoneumlaget ved hjælp af 45 centimeter lange belagte og flettede opløselige suturer med en 13 millimeter, tre ottendedele cirkelnållegering. Efter suturering af peritoneumlaget sutureres huden med opløselige suturer ved hjælp af den samme type opløselige suturer, der anvendes til peritoneum. Når sutureringen er afsluttet, påføres vævslim på suturerne på huden.Når vævslimet er tørret, skal du slukke for fordamperen og overføre dæmningen fra operationsområdet til et støttende bur på ryggen. Placentas blev injiceret med et generelt CRISPR Cas9 kontrolplasmid og aktiveringskontrol CRISPR-plasmid eller et IGF-1 SAM-aktiveringsplasmid. De repræsentative billeder efter obduktion viste ingen mærkbar skade eller ændring i fænotypisk udseende i nogen behandlingsgrupper.Overlevelsesraten for de ubehandlede embryoner i manipulerede kuld faldt til et gennemsnit på 79,05%, mens der var et signifikant fald i overlevelsen af de manipulerede embryoner i gennemsnit 55,56%Der var ingen signifikant forskel i nogen gruppes placentavægt. Der var ingen signifikant forskel i moderens vægtøgning umiddelbart efter operationen sammenlignet med fingeroperationer. Mange gravide mødre viste et lille fald eller ingen ændring i vægt dagen efter proceduren, sandsynligvis på grund af forstyrret spisning under og kort efter operationen.De fleste dæmninger viste øget vægt på E14.5, men lejlighedsvis blev der stadig observeret et fald i vægt. qPCR viste en signifikant stigning i IGF-1 ekspression i IGF-1 overekspression placentas versus kontrol placentas. ELIZA vurdering af E14.5 placentas viste en signifikant stigning i IGF-1 protein niveauer i IGF-1 overekspression placentas versus kontrol placentas.Grøn autofluorescens demonstrerede underregionerne i placenta maternal føtal grænseflade med rød Cas9 mærkning i kun IGF-1 overekspression placenta, hvilket indikerer vellykket CRISPR inkorporering i alle tre underregioner af moderkagen. Den fluorescerende i C2 hybridisering mærkning bekræftede inkorporeringen af IGF-1 aktivering plasmid uden migration i ubehandlede placenta. Den deciduale og labyrintzone kunne identificeres omkring den røde krydszone markeret med Prl8a8-farvning.Husk at registrere manipulationstype og placering af moderkager og tilsvarende embryoner. Det anbefales stærkt at registrere placeringen af livmoderhalsen og embryonerne i livmoderhornene. Efter denne procedure kan analyse af moderkagen, embryoet og dæmningen udføres.Dette vil give mulighed for en større forståelse af gener placenta specifikke roller i graviditet, placenta funktion, og embryonal udvikling.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetisk Manipulation af afgroedesygdomme<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; At studere Fungal Biology og Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; Mutagenese af histon-gener i knopskydende gær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordiale kønsceller Transplantation til CRISPR/Cas9-baserede kvantespring i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-medieret målrettede Integration In Vivo ved hjælp af en homologi-medieret End at deltage-baseret strategi

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation af Ploidi i Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Genom-redigering i pattedyr cellelinjer ved hjælp af CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulation af genfunktioner i mexicansk Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...