Name: mouse in vivo placental targeted crispr manipulation
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation at JoVE.com

Авторы признают следующие источники финансирования: R01 MH122435, NIH T32GM008629 и NIH T32GM145441. Авторы благодарят лаборатории доктора Вэла Шеффилда и доктора Кельвина Картера в Университете Айовы за использование их операционной комнаты и оборудования, а также доктора Эрика Ван Оттерлоо, доктора Нандакумара Нараянана и доктора Мэтью Вебера за их помощь в микроскопии. Авторы также благодарят доктора Сару Маурер, Майю Эванс и Шрилеху Кунду за их помощь в проведении пилотных операций.

Все процедуры были выполнены в соответствии с федеральными правилами и политикой Университета Айовы и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию.
1. Животные и животноводство
<ol><li>Держите животных в 12-часовом световом дневном цикле с едой ...

<ol>
	<li>Cross, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).</li><li>Perez-Garcia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placentation+defects+are+highly+prevalent+in+embryonic+lethal+mouse+mutants.">Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants.</a> Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).</li><li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta-brain-axis.">The placenta-brain-axis.</a> Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).</li><li>Maslen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+placenta-heart+interactions.">Recent advances in placenta-heart interactions.</a> Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).</li><li>Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+horizons+for+neurodevelopmental+disorders:+Placental+mechanisms.">Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms.</a> Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).</li><li>Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+placental+development+and+its+impact+on+fetal+growth-new+insights+from+mouse+models.">Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).</li><li>Goeden, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Inflammation+disrupts+fetal+neurodevelopment+via+increased+placental+output+of+serotonin+to+the+fetal+brain.">Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain.</a> Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).</li><li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease.">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li><li>Wilson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+commonly+expressed+genes+between+first+trimester+fetal+heart+and+placenta+cell+types+in+the+context+of+congenital+heart+disease.">Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).</li><li>Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Genetic+manipulation+of+the+rodent+placenta.">Review: Genetic manipulation of the rodent placenta.</a> Placenta. 32, S130-S135 (2011).</li><li>Wenzel, P. L., Leone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cre+recombinase+in+early+diploid+trophoblast+cells+of+the+mouse+placenta.">Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta.</a> Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).</li><li>Zhou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+placental-specific+DNA+recombination+in+transgenic+mice.">Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice.</a> PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).</li><li>Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+promoter-directed+expression+of+cre+recombinase+in+mouse+placenta.">The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta.</a> Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).</li><li>Nadeau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Map2k1+and+Map2k2+genes+contribute+to+the+normal+development+of+syncytiotrophoblasts+during+placentation.">Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation.</a> Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).</li><li>Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+trophoblast-specific+genetic+manipulation+using+lentiviral+delivery.">Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery.</a> BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).</li><li>Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+placental+defects+and+embryonic+lethality+by+trophoblast-specific+lentiviral+gene+transfer.">Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer.</a> Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).</li><li>Lecuyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+placental+marker+of+fetal+brain+defects+after+in+utero+alcohol+exposure.">a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).</li><li>Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral-mediated+placental+gene+transfer+of+IGF-1+corrects+placental+insufficiency+via+enhanced+placental+glucose+transport+mechanisms.">Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms.</a> PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).</li><li>Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+amino+acid+transporters+by+adenoviral-mediated+human+insulin-like+growth+factor-1+in+a+mouse+model+of+placental+insufficiency+in+vivo+and+the+human+trophoblast+line+BeWo+in+vitro.">Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro.</a> Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).</li><li>Song, A. J., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+and+avoiding+problems+when+using+the+Cre-lox+system.">Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system.</a> Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).</li><li>Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosafety+of+adenoviral+vectors.">Biosafety of adenoviral vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).</li><li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes.">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+Lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: Lessons from mouse mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Elmore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histology+atlas+of+the+developing+mouse+placenta.">Histology atlas of the developing mouse placenta.</a> Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).</li><li>Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+phenotype+and+the+insulin-like+growth+factors:+Resource+allocation+to+fetal+growth.">Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth.</a> The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).</li><li>Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factors+in+embryonic+and+fetal+growth+and+skeletal+development+(Review).">Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review).</a> Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).</li><li>Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear+by+in+vivo+electroporation.">Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).</li><li>Elser, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+maternal+exposure+to+cypermethrin+and+stress+affect+embryonic+brain+and+placental+outcomes+in+mice.">Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice.</a> Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).</li><li>Gumusoglu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+maternal+interleukin-17+and+autism-related+cortical+gene+expression,+neurobiology,+and+behavior.">Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior.</a> Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).</li><li>Liu, F., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+gene+transfer+to+the+liver+following+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).</li><li>Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+via+sonoporation+and+electroporation.">Introduction of genes via sonoporation and electroporation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).</li><li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+gene+editing+using+ribonucleoproteins+in+skin+stem+cells+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+mouse+model.">Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).</li><li>Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).</li><li>Bond, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+and+coordination+of+neurogenesis+and+astrogenesis+in+developing+mouse+hippocampal+subregions.">Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions.</a> Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).</li><li>Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+developmental+events+in+the+early+mouse+embryo.">Timing of developmental events in the early mouse embryo.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).</li><li>Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+trophoblast+cells+and+trophoblast+invasion+assay.">Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).</li><li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+Interference+efficiently+induces+specific+and+reversible+gene+silencing+in+human+iPSCs.">CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li><li>Dai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+CRISPRa+screen+identifies+putative+enhancers.">Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers.</a> Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).</li><li>Ursini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+genomic+risk+scores+and+early+neurodevelopmental+outcomes.">Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).</li><li>Smajdor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+fetal+surgery.">Ethical challenges in fetal surgery.</a> Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).</li><li>Antiel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethical+challenges+in+the+new+world+of+maternal-fetal+surgery.">Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery.</a> Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).</li></ol>

Плацента является основным регулятором роста плода, и, как отмечалось ранее, изменения в экспрессии или функции плацентарных генов могут существенно повлиять на развитие плода6. Протокол, изложенный здесь, может быть использован для выполнения целенаправленных манипуляц?...

Плацента является важным органом, участвующим в развитии плода. Основная роль плаценты заключается в обеспечении необходимых факторов и регулировании передачи питательных веществ и отходов плоду и от него. Плаценты млекопитающих состоят как из плодной, так и из материнской ткани, которые составляют интерфейс плода и матери, и, таким образом, генетика как матери, так и плода влияет на функцию1. Генетические аномалии или нарушение функции плаценты могут резко изменить развитие плода. Предыдущая работа показала, что генетика и развитие плаценты связаны с измененным развитием определенных систем органов у плода. В частности, аномалии в плаценте связаны с изменениями в мозге, сердце и сосудистой системе плода 2,3,4,5.
Транспорт гормонов, факторов роста и других молекул от плаценты к плоду играет важную роль в развитии плода6. Было показано, что изменение плацентарной продукции определенных молекул может изменить развитие нервной системы. Воспаление матери может увеличить выработку серотонина за счет изменения экспрессии метаболического гена триптофана (TRP) в плаценте, что впоследствии создает накопление серотонина в мозге плода7. Другие исследования обнаружили аномалии плаценты наряду с пороками сердца. Считается, что аномалии в плаценте способствуют врожденным порокам сердца, наиболее распространенному врожденному дефекту у людей8. Недавнее исследование выявило несколько генов, которые имеют сходные клеточные пути как в плаценте, так и в сердце. Если эти пути нарушены, они могут вызвать дефекты в обоих органах9. Дефекты плаценты могут усугубить врожденные пороки сердца. Роль генетики и функции плаценты в развитии специфической системы органов плода является новой областью исследований.
У мышей есть гемохориальная плацента и другие особенности плаценты человека, что делает их очень полезными моделями для изучения заболеваний человека1. Несмотря на важность плаценты, в настоящее время отсутствуют целенаправленные генетические манипуляции in vivo. Кроме того, в настоящее время существует больше вариантов нокаутов или нокдаунов, чем манипуляции с чрезмерной экспрессией или усилением функции в плаценте10. Существует несколько трансгенных линий, экспрессирующих Cre, для плацентарно-специфических манипуляций, каждая из которых находится в разных линиях трофобласта в разные моменты времени. К ним относятся Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER и Gcm1-Cre11,12,13,14. Хотя эти трансгены Cre эффективны, они могут быть не способны манипулировать некоторыми генами в определенные моменты времени. Другим широко используемым методом нокаута или сверхэкспрессии экспрессии плацентарных генов является встраивание лентивирусных векторов в культуру бластоцисты, что вызывает специфическую для трофобласта генетическую манипуляцию15,16. Этот метод позволяет добиться устойчивого изменения экспрессии плацентарных генов на ранних стадиях развития. Использование РНК-интерференции in vivo редко используется в плаценте. Вставка плазмид шРНК может быть выполнена аналогично методу CRIPSR, описанному в этой статье. Это было сделано на E13.5 для успешного снижения экспрессии PlGF в плаценте, что влияет на сосудистую сеть мозгапотомства 17.
В дополнение к методам, которые в основном используются для нокаута или нокдауна, индуцирование сверхэкспрессии обычно выполняется с помощью аденовирусов или введения экзогенного белка. Методы, используемые для сверхэкспрессии, имеют разную степень успеха и в основном выполняются на более поздних сроках беременности. Для изучения роли инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) в функции плаценты был проведен аденовирально-опосредованный перенос плацентарного гена для индуцирования сверхэкспрессии гена IGF-1 18,19. Это было выполнено на поздних сроках беременности мыши на E18.5 с помощью прямой плацентарной инъекции. Чтобы предоставить дополнительные возможности и обойти возможные неудачи установленных плацентарных генетических манипуляций, таких как сбои комбинации Cre-Lox, возможная токсичность аденовирусов и нецелевые эффекты шРНК, можно использовать прямые манипуляции CRISPR с плацентой in vivo 20,21,22. Эта модель была разработана для решения проблемы отсутствия моделей сверхэкспрессии и создания модели с гибкостью.
Этот метод основан на работе Lecuyer et al., в которой плазмиды shRNA и CRISPR были нацелены непосредственно in vivo на плаценты мыши для изменения экспрессии PlGF 17. Этот метод может быть использован для непосредственного изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций CRISPR в несколько моментов времени; для этой работы был выбран Е12.5. Плацента к этому моменту созрела и достаточно велика, чтобы ею можно было манипулировать, что позволяет вставлять специфическую плазмиду CRISPR на E12.5, что может оказать значительное влияние на развитие плода от середины до конца беременности23,24. В отличие от трансгенных подходов, но подобно вирусной индукции или РНК-интерференции, этот метод допускает сверхэкспрессию или нокаут в определенные моменты времени с использованием относительно продвинутого хирургического подхода, что позволяет избежать возможного нарушения плацентации или эмбриональной летальности из-за более ранних изменений. Поскольку только несколько плацент получают экспериментальную или контрольную плазмиду в помете, подход допускает два типа внутреннего контроля. Этими контрольными элементами являются те, которые вводят и электропорируют соответствующую контрольную плазмиду, и те, которые не подвергаются прямым манипуляциям. Этот метод был оптимизирован для создания сверхэкспрессии гена IGF-1 в плаценте мыши с помощью плазмиды CRISPR синергетического медиатора активации (SAM). Был выбран ген IGF-1, так как IGF-1 является важным гормоном роста, доставляемым плоду, который в основном вырабатывается в плаценте до рождения25,26. Этот новый метод CRISPR, нацеленный на плаценту, позволит проводить прямые манипуляции, чтобы помочь определить связь между функцией плаценты и развитием плода.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 ml Tubes</td>
			<td >USA Scientific Inc</td>
			<td >1615-5500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >J61899.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 Well plate</td>
			<td >Cornings</td>
			<td >3598</td>
			<td>For BCA kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Absorbent Underpads</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >14-206-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Activation Control Plasmid</td>
			<td >Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-437275</td>
			<td>Dnase-free water provided for dilution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AMV Reverse Transcriptase</td>
			<td >New England Biolabs</td>
			<td >M0277L</td>
			<td>Use for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anesthetic Gas Vaporizor</td>
			<td>Vetamac</td>
			<td >VAD-601TT</td>
			<td>VAD-compact vaporizer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Artifical Tear Gel</td>
			<td >Akorn</td>
			<td >NDC 59399-162-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td>Protein quantification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biovortexer</td>
			<td >Bellco Glass, Inc.</td>
			<td >198050000</td>
			<td>Hand-held tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellSens Software</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >V4.1.1</td>
			<td>Image processing to FISH images.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge 5810</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >EP022628168</td>
			<td>Plate centrifuge</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >J67241-AP</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cotton Tipped Applicators</td>
			<td >ProAdvantage</td>
			<td >77100</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CRISPR/Cas9 Control Plasmid</td>
			<td >Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-418922</td>
			<td>Dnase-free water provided for dilution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CryoStat</td>
			<td >Leica</td>
			<td >CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissection Microscope</td>
			<td >Leica</td>
			<td >M125 C</td>
			<td>Used for post-necroscopy imaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissolvable Sutures</td>
			<td >Med Vet International</td>
			<td >J385H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Distilled Water</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td >Thermo fisher Scientific</td>
			<td >14190144</td>
			<td>(-) Calcium; (-) Magnesium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0662</td>
			<td>Generator only</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Electric Razor</td>
			<td >Wahl</td>
			<td >CL9990</td>
			<td>Kent Scientific</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Electroporation paddles/Tweezertrodes</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0487</td>
			<td>3 mm diameter paddles; wires included</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Embedding Cassette: 250 PK</td>
			<td >Grainger</td>
			<td >21RK94</td>
			<td>Placenta embedding cassettes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >268280010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >F-Air Canisters</td>
			<td >Penn Veterinary Supply Inc</td>
			<td >BIC80120</td>
			<td>Excess isoflurane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fast Green Dye FCF</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F7252-5G</td>
			<td>Dissolve to 1 &#956;g/ml and filter; protect from light</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter-based microplate photometer (plate reader)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >14377576</td>
			<td>Can be used for BCA and ELISA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Forceps</td>
			<td >VWR</td>
			<td >82027-386</td>
			<td>Fine tips, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >B150-86-10</td>
			<td>O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >1861281</td>
			<td>Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Heating Pad</td>
			<td >Thermotech</td>
			<td >S766D</td>
			<td>Digitial Moist Heating Pad</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hemostats</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10806-188</td>
			<td>Fully surrated jaw; curved</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hot Water Bath</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >20253</td>
			<td>Isotemp 205</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Igf-1 SAM Plasmid (m1)</td>
			<td >Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td >sc-421056-ACT</td>
			<td>Dnase-free water provided for dilution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Induction Chamber</td>
			<td >Vetamac</td>
			<td >941443</td>
			<td>No specific liter size required</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane</td>
			<td >Piramal Pharma Limited</td>
			<td >NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoproponal/2-Proponal</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >A451-4</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine HCl 100mg/ml</td>
			<td >Akorn</td>
			<td >NDC 59399-114-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MgCl2/Magneisum Chloride</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >63069-100ML</td>
			<td>1M. Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MicroAmp&#8482; Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >4309849</td>
			<td>Barcoded plates not required</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcapillary Tip</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5196082001</td>
			<td>Attached to BTX Microinjector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjector</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0766</td>
			<td>Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microject 1000A (Injection Machine)</td>
			<td >BTX Harvard Apparatus</td>
			<td >45-0751</td>
			<td>MicroJect 1000A Plus System</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td >Sutter Instrument</td>
			<td >P-97</td>
			<td>Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate Mixer (Plate Shaker)</td>
			<td >scilogex</td>
			<td >822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit</td>
			<td >R &#38; D Systems</td>
			<td >MG100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needles</td>
			<td >BD - Becton, Dickson, and Company</td>
			<td >305106</td>
			<td>30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nitrogen Tank</td>
			<td >Linde</td>
			<td >7727-37-9</td>
			<td>Any innert gas</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)</td>
			<td >Norbrook Laboratories Limited</td>
			<td >NDC 55529-040-10</td>
			<td>Analesgic such as Meloxicam</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nose Cone</td>
			<td >Vetamac</td>
			<td >921609</td>
			<td>9-14 mm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Opal 620 detection dye</td>
			<td >Akoya Biosciences</td>
			<td >SKU FP1495001KT</td>
			<td>Used for FISH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound</td>
			<td >Sakura</td>
			<td >4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen Tank</td>
			<td >Linde</td>
			<td >7782 - 44 - 7</td>
			<td>Medical grade oxygen</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pestles</td>
			<td >USA Scientific Inc</td>
			<td >14155390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine Solution, 5%</td>
			<td >Avrio Health L.P.</td>
			<td >NDC 67618-155-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Power SYBR&#8482; Green PCR Master Mix</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >4367659</td>
			<td>Use for qPCR</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Random Hexamers (Random Primers)</td>
			<td >New England Biolabs</td>
			<td >S1330S</td>
			<td>Use for cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Razor Blade</td>
			<td >Grainger</td>
			<td >26X080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNA Cleanup Kit &#38; Concentrator</td>
			<td >Zymo Research</td>
			<td >R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNALater</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >AM7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAscope kit v.2.5</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >323100</td>
			<td >Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAscope&#8482; Probe- Mm-Prl8a8-C2</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >&#160;528641-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAscope&#8482; Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >527421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Roto-Therm Mini</td>
			<td >Benchmark</td>
			<td >R2020</td>
			<td>Dry oven for in situ hybridization</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scissors</td>
			<td >VWR</td>
			<td >82027-578</td>
			<td>Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#185;/&#8322;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride (Saline)</td>
			<td >Hospra</td>
			<td >NDC 0409-4888-03</td>
			<td>Sterile,&#160; 0.9%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate]</td>
			<td >Research Product International</td>
			<td >03-04-6132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >SS277</td>
			<td>Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steamer</td>
			<td >Bella</td>
			<td >B00DPX8UBA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Surgical Drape</td>
			<td >Busse</td>
			<td >696</td>
			<td>Sterilize before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgipath Cover Glass 24x60</td>
			<td >Leica</td>
			<td >3800160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringes</td>
			<td >BD - Becton, Dickson, and Company</td>
			<td >309659</td>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Invitrogen&#8482; Nanodrop&#8482; One Spectrophotometer with WiFi and Qubit&#8482; 4 Fluorometer</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-400-525</td>
			<td>This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.&#160; Qubit quantification not required.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue Adhesive</td>
			<td >3M</td>
			<td >1469SB</td>
			<td>VetBond</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris HCl</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15568025</td>
			<td>1M. Protein homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol&#8482; Reagent</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >15596018</td>
			<td>RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TSA Buffer Pack</td>
			<td >Advanced Cells Diagnostics</td>
			<td >322810</td>
			<td>Used to dilute Opal 620 detection dye</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Universal F-Circuit</td>
			<td >Vetamac</td>
			<td >40200</td>
			<td>Attached to vaporizer and vaporizer accessories</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Upright Compound Fluorescence Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >BX61VS</td>
			<td>Used for FISH imaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vectorshield with DAPI</td>
			<td >Vector Laboratories</td>
			<td >H-1200</td>
			<td>Coverslip mounting media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ViiA&#8482; 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >4453536</td>
			<td>This is for SYBR 384-well block detection.&#160; TaqMan and/or smaller blocks available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color</td>
			<td >Amazon</td>
			<td >C450B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine 20mg/ml</td>
			<td >Anased</td>
			<td >343730_RX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse in vivo placental targeted crispr manipulation

Плацента является важным органом, который регулирует и поддерживает развитие млекопитающих в утробе матери. Плацента отвечает за передачу питательных веществ и отходов между матерью и плодом, а также за выработку и доставку факторов роста и гормонов. Плацентарные генетические манипуляции у мышей имеют решающее значение для понимания специфической роли плаценты во внутриутробном развитии. Плацентарно-специфические трансгенные мыши, экспрессирующие Cre, имеют различную эффективность, и другие методы манипулирования плацентарными генами могут быть полезными альтернативами. В этой статье описывается метод прямого изменения экспрессии плацентарных генов с использованием манипуляций с генами CRISPR, который может быть использован для модификации экспрессии целевых генов. Используя относительно продвинутый хирургический подход, беременные матери подвергаются лапаротомии на эмбриональный день 12,5 (E12,5), и плазмида CRISPR доставляется стеклянной микропипеткой в отдельные плаценты. Плазмида сразу же подвергается электропорации после каждой инъекции. После восстановления матери плаценты и эмбрионы могут продолжать развитие до оценки в более поздний момент времени. Оценка состояния плаценты и потомства после использования этого метода может определить роль специфической во времени функции плаценты в развитии. Этот тип манипуляции позволит лучше понять, как генетика и функция плаценты влияют на рост и развитие плода в контексте множественных заболеваний.

Общие результаты процедуры (рис. 6) В исследовании было три манипулируемые группы. К ним относятся плаценты, которым вводили общую контрольную плазмиду CRISPR Cas9 (Cas9 Control), контрольную плазмиду CRISPR активации (Act Control) или активационную плазмиду IGF-1 SAM (Ig...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation at JoVE.com

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Здесь мы описываем специфический по времени метод эффективного манипулирования критическими путями развития плаценты мыши in vivo. Это выполняется путем инъекции и электропорации плазмид CRISPR в плаценты беременных маток на эмбриональный день 12,5.

Мышь in vivo Плацентарная манипуляция CRISPR

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Этот протокол имеет большое значение, поскольку он позволяет целенаправленно манипулировать плацентами мыши с помощью CRISPR. Это позволит исследователям выяснить конкретные функции генов во время средней и поздней беременности. Генетические манипуляции, вызывающие чрезмерную экспрессию в плаценте мыши, встречаются очень редко.Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет проводить ряд изменений экспрессии генов в плаценте. Не расстраивайтесь, если предварительные сроки у этой методики окажутся неудачными. Поскольку эта техника сложна, для ее освоения требуется довольно много времени.Для начала поместите обезболиваемую матери на спину с носовым конусом для поддержания анестезии в области препарирования. Тщательно побрейте брюшко плотины. Чтобы предотвратить высыхание роговицы, нанесите искусственный слезный гель на оба глаза плотины.Затем используйте стерильные аппликаторы с ватными наконечниками для дезинфекции места операции не менее чем тремя чередующимися раундами раствора повидон-йода, а затем 70% этанола с последним слоем раствора повидон-йода. После подготовки переместите плотину с носовым конусом анестезии в назначенную операционную зону. Для лапаротомии матки поместите лежа на спине на операционном столе и закрепите конус носа на месте с помощью ленты.Поместите грелку под впитывающую прокладку, установленную на 45 градусов по Цельсию. После подтверждения глубины анестезии по отсутствию рефлюкса при защемлении пальцев ног используйте щипцы и ножницы, чтобы сделать примерно двухсантиметровый разрез по средней линии через закрытую кожу. Затем делают вертикальный разрез через брюшину с помощью стерильных щипцов, аккуратно отщипывающих от рогов матки.Массируйте оба рога матки, надавливая пальцами на обе стороны живота, чтобы направлять их. Поместите открытую матку поверх стерильных хирургических простыней, размещенных над нижней частью живота, и держите ее влажной с каплями теплого стерильного физиологического раствора по мере необходимости. После того, как матка обнажена, выберите три пары плацент для манипуляции.Зафиксируйте место проведения плацентарных манипуляций и организацию эмбрионов в пределах рогов матки. Для плацентарной инъекции контрольной плазмиды загрузите достаточное количество соответствующей контрольной плазмиды для трех инъекций с помощью калиброванной микропипетки. Выполняйте все инъекции между децидуа и соединительной зоной на глубине примерно 0,5 миллиметра латерально в плаценту.После инъекции, но непосредственно перед электропорацией, покройте места контакта стерильным физиологическим раствором, нанося физиологический раствор точно на три участка на стенке матки и лопатки с помощью капельницы или шприца. В течение двух минут после инъекции выполните электропорацию с помощью пары трехмиллиметровых лопастей, прикрепленных к электропорационной машине. Чтобы обеспечить эффективность включения CRISPR и жизнеспособность эмбрионов, отрегулируйте настройки на 30 вольт, 30-миллисекундный импульс, два импульса, 970-миллисекундный импульс выключен и униполярный.Аккуратно надавите электропорационными лопатками на стенки матки с боковых сторон плаценты. Поместите лопасть анода над местом впрыска и катодом прямо напротив. Нажмите на импульс на электропорационной машине и дождитесь завершения двух импульсов, прежде чем снимать электропорационные лепестки.Затем приступают к плацентарной инъекции экспериментальной плазмиды, как показано ранее. Проведите электропорацию всех трех экспериментальных инъецированных плацент в течение двух минут после инъекции, как это было сделано в контрольной группе. После завершения манипуляций с плацентой аккуратно помассируйте рога матки обратно в брюшную полость, используя только пальцы, чтобы непосредственно манипулировать рогами матки.Выполните прерывистые швы на брюшинном слое, используя 45-сантиметровые и плетеные рассасывающиеся швы из 13-миллиметрового круга из игольчатого сплава длиной три восьмых. После наложения швов на слой брюшины наложите на кожу рассасывающиеся швы, используя тот же тип рассасывающихся швов, что и брюшину. После завершения наложения швов нанесите тканевый клей на швы на коже.Когда тканевый клей высохнет, выключите испаритель и перенесите плотину из области операции в поддерживающую клетку на спине. Плацентам вводили общую контрольную плазмиду CRISPR Cas9 и контрольную плазмиду активации CRISPR или плазмиду активации IGF-1 SAM. Репрезентативные изображения после вскрытия не показали заметных повреждений или изменений в фенотипическом виде ни в одной из групп лечения.Выживаемость необработанных эмбрионов в модифицированных пометах снизилась в среднем до 79,05%, в то время как выживаемость обработанных эмбрионов значительно снизилась в среднем до 55,56%Существенной разницы в весе плаценты ни в одной группе не было. Не было существенной разницы в увеличении веса матери сразу после операции по сравнению с фиктивными операциями. У многих беременных женщин наблюдалось небольшое снижение или отсутствие изменений в весе на следующий день после процедуры, вероятно, из-за нарушения приема пищи во время и вскоре после операции.Большинство плотин показали увеличение веса на E14.5, но иногда снижение веса все же наблюдалось. КПЦР показала значительное увеличение экспрессии IGF-1 в плацентах с избыточной экспрессией IGF-1 по сравнению с контрольными плацентами. Оценка ELIZA плаценты E14.5 показала значительное повышение уровня белка IGF-1 в плацентах с избыточной экспрессией IGF-1 по сравнению с контрольными плацентами.Зеленая аутофлуоресценция продемонстрировала субобласти интерфейса плацентарного материнского плода с красной маркировкой Cas9 только в плаценте гиперэкспрессии IGF-1, что указывает на успешное включение CRISPR во все три субобласти плаценты. Флуоресцентная маркировка при С2-гибридизации подтвердила включение активационной плазмиды IGF-1 без миграции в необработанные плаценты. Децидуальная и лабиринтная зона могут быть идентифицированы вокруг красной зоны соединения, отмеченной окрашиванием Prl8a8.Не забудьте записать тип манипуляции и расположение плаценты и соответствующих эмбрионов. Настоятельно рекомендуется регистрировать расположение шейки матки и эмбрионов в рогах матки. После этой процедуры может быть выполнен анализ плаценты, эмбриона и матери.Это позволит лучше понять специфические роли генов плаценты в беременности, плацентарной функции и эмбриональном развитии.

Research

JoVE Journal

Genetics

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Генетическая Манипуляция растений Возбудитель<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; По изучению Грибковые биологии и растений микробных взаимодействий

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Манипуляция плоидности в Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Эндогенного белка, пометки в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

Геном редактирование в Mammalian клеток линии, используя ТРИФОСФАТЫ-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Манипуляции функции гена в мексиканской Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...