Name: thermal limits determination for zooplankton using a heat block
Uploaded: 2022-11-18T14:50:00
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Questo lavoro è supportato dal Faculty Research Fund dello Swarthmore College [KC] e dalla Robert Reynolds and Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship per BJ.

1. Fabbricazione del blocco termico
<ol><li>Collegare il riscaldatore a strisce da 120 V, 100 W al reostato (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare il blocco di alluminio di 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pollici x 5 pollici x 2 pollici) praticando 60 fori in una griglia 6 x 10 (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi che i fori siano distanziati di 2 cm da centro a centro in entrambe le direzioni. Ciascuno dovrebbe avere un diametro di 1,1 cm e una profond...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Garc&#237;a, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temperature+alter+the+relationship+between+biodiversity+and+ecosystem+functioning.">Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).</li><li>Sinclair, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+predict+ectotherm+responses+to+climate+change+using+thermal+performance+curves+and+body+temperatures.">Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures.</a> Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+history+and+critique.">The critical thermal maximum: history and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Bennett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+critical+thermal+limits+of+life+on+Earth.">The evolution of critical thermal limits of life on Earth.</a> Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).</li><li>Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+and+the+global+redistribution+of+animals.">Thermal tolerance and the global redistribution of animals.</a> Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).</li><li>Deutsch, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impacts+of+climate+warming+on+terrestrial+ectotherms+across+latitude.">Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).</li><li>Collin, R., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+urchin+Lytechinus+variegatus+lives+close+to+the+upper+thermal+limit+for+early+development+in+a+tropical+lagoon.">The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon.</a> Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).</li><li>Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+thermal+sensitivities+among+different+life+stages+of+the+pulmonate+limpet+Siphonaria+japonica.">Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica.</a> Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).</li><li>Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+temperature+and+salinity+on+early+life+stages+of+the+sea+urchin+Heliocidaris+crassispina.">Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina.</a> Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).</li><li>Strathmann, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+larva+of+marine+invertebrates.">Culturing larva of marine invertebrates.</a> Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).</li><li>Stillman, J. H., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+the+upper+thermal+tolerance+limits+of+Eastern+Pacific+porcelain+crabs,+Genus+Petrolisthes:+Influences+of+latitude,+vertical+Zonation,+acclimation,+and+phylogeny.">A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).</li><li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+patterns+of+thermal+tolerance+and+phenotypic+plasticity+with+population+genetics+to+improve+understanding+of+vulnerability+to+warming+in+a+widespread+copepod.">Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod.</a> Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).</li><li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+differentiation+underlies+seasonal+variation+in+thermal+tolerance,+body+size,+and+plasticity+in+a+short-lived+copepod.">Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod.</a> Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).</li><li>Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+potential+for+adaptation+to+climate+change+in+a+broadly+distributed+marine+crustacean.">Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).</li><li>Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+parental+effects+confers+rapid+larval+thermal+tolerance+in+the+estuarine+anemone+Nematostella+vectensis.">Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis.</a> Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).</li><li>Sewell, M. A., Young, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+limits+to+fertilization+and+early+development+in+the+tropical+sea+urchin+Echinometra+lucunter.">Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).</li><li>Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+larvae+of+Pollicipes+elegans,+a+marine+species+with+an+antitropical+distribution.">Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution.</a> Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).</li><li>Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+in+place+and+moving+in+space:+contrasting+larval+thermal+sensitivity+explains+distributional+changes+of+sympatric+sea+urchin+species+to+habitat+warming.">Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming.</a> Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).</li><li>Zippay, M. L., Hofmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+tolerances+across+latitudes:+thermal+sensitivity+of+larval+marine+snails+(Nucella+spp).">Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp).</a> Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).</li><li>Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+early+development+predicts+the+realized+thermal+niche+in+marine+ectotherms.">Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms.</a> Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">R: A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2021).</li><li>Venables, W. N., Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).</li><li>Fumo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextualizing+marine+heatwaves+in+the+southern+California+bight+under+anthropogenic+climate+change.">Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change.</a> Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).</li><li>Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+median+lethal+concentration+values+using+confidence+interval+overlap+or+ratio+tests.">Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).</li><li>Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+upper+thermal+limits+to+acute+and+chronic+temperature+variation+in+Manduca+sexta+larvae.">Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).</li><li>Kuo, E. S. L., Sanford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+in+the+upper+thermal+limits+of+an+intertidal+snail:+implications+for+climate+envelope+models.">Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models.</a> Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).</li><li>Hammond, L. M., Hofmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+Strongylocentrotus+purpuratus+early+life+history+stages:+mortality,+stress-induced+gene+expression+and+biogeographic+patterns.">Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns.</a> Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).</li><li>Sasaki, M., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+copepod+thermal+tolerance.">Global patterns in copepod thermal tolerance.</a> Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).</li></ol>

Questo protocollo fornisce un approccio accessibile e personalizzabile per determinare i limiti termici di piccoli organismi plancton attraverso l'esposizione termica acuta. Il design a 10 fori e i punti finali di temperatura flessibili, controllati dal bagno d'acqua all'estremità inferiore e dal riscaldatore all'estremità superiore, consentono di determinare LT50 con precisione. Utilizzando questo approccio, è stata rilevata una differenza nel limite termico di <1 °C (Figura 3</strong...

La tolleranza termica è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione degli organismi 1,2. Mentre il pianeta continua a riscaldarsi a causa delle emissioni antropogeniche di carbonio, viene prestata crescente attenzione alla determinazione e all'applicazione dei limiti termici3. Vari endpoint, come la mortalità, il mancato sviluppo e la perdita di mobilità, sono stati utilizzati per determinare i limiti termici superiori e inferiori4. Questi limiti termici sono spesso considerati un proxy per la nicchia termica di un organismo. Queste informazioni vengono a loro volta utilizzate per identificare le specie più vulnerabili al riscaldamento globale, nonché per prevedere la distribuzione futura delle specie e le interazioni delle specie risultanti 3,5,6,7. Tuttavia, determinare i limiti termici, specialmente per i piccoli organismi planctonici, può essere difficile.
Per gli organismi planctonici, in particolare gli stadi larvali degli invertebrati marini, il limite termico può essere determinato attraverso l'esposizione cronica. L'esposizione cronica si ottiene allevando larve a diverse temperature per giorni o settimane e determinando la temperatura alla quale la sopravvivenza larvale e/o il tasso di sviluppo si riduconodi 8,9,10. Tuttavia, questo approccio richiede piuttosto tempo e richiede grandi incubatori ed esperienza nell'allevamento delle larve (vedi riferimento11 per una buona introduzione alla coltura di larve di invertebrati marini).
In alternativa, l'esposizione acuta allo stress termico può essere utilizzata per determinare i limiti termici. Spesso, questo approccio di determinazione comporta il posizionamento di piccole fiale con larve in bagni asciutti a temperatura controllata 12,13,14, sfruttando le funzioni di gradiente termico nei termociclatori PCR 15,16, o mettendo fiale di vetro / tubi di microcentrifuga lungo un gradiente termico generato dal riscaldamento e raffreddamento applicati alle estremità di grandi blocchi di alluminio con fori in cui le fiale si adattano perfettamente 17, 18,19. I tipici bagni secchi generano una singola temperatura; Pertanto, è necessario utilizzare più unità contemporaneamente per valutare le prestazioni in un intervallo di temperature. I termociclatori generano un gradiente, ma possono contenere solo un piccolo volume di campione (120 μL) e richiedono un'attenta manipolazione. Simile ai termociclatori, i grandi blocchi di alluminio creano gradienti di temperatura lineari e stabili. Entrambi gli approcci possono essere accoppiati con la regressione logistica o probit per calcolare la temperatura letale per il 50% della popolazione (LT50)12,20,21. Tuttavia, i blocchi di alluminio utilizzati erano lunghi ~ 100 cm; Questa dimensione richiede un ampio spazio di laboratorio e l'accesso a fresatrici a controllo numerico computerizzate specializzate per praticare i fori. Insieme all'utilizzo di due bagni d'acqua di livello di ricerca per mantenere la temperatura target, il costo finanziario dell'assemblaggio della configurazione è elevato.
Pertanto, questo lavoro mira a sviluppare un mezzo alternativo per generare un gradiente di temperatura stabile e lineare con parti disponibili in commercio. Tale prodotto deve avere un ingombro ridotto e deve poter essere facilmente utilizzato per esperimenti di esposizione acuta allo stress termico per organismi planctonici. Questo protocollo è sviluppato con zooplancton di dimensioni <1 mm come organismi bersaglio e, quindi, è stato ottimizzato per l'uso di una provetta da microcentrifuga da 1,5 o 2 ml. Gli organismi di studio più grandi richiederanno contenitori più grandi delle provette di microcentrifuga da 1,5 ml utilizzate e fori allargati nei blocchi di alluminio.
Oltre a rendere più accessibile l'apparato sperimentale, questo lavoro mira a semplificare la pipeline di elaborazione dei dati. Mentre il software statistico commerciale fornisce routine per calcolare LT50 utilizzando la regressione logistica o probit, il costo della licenza non è banale. Pertanto, uno script facile da usare che si basa sul programma statistico open source R22 renderebbe l'analisi dei dati più accessibile.
Questo protocollo mostra come un blocco termico compatto può essere fabbricato con parti disponibili in commercio ed essere applicato per esporre lo zooplancton (larve del dollaro di sabbia Dendraster excentricus) allo stress termico acuto per determinare il loro limite termico superiore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m membrane filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74300-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189;&#8221; Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K266</td>
			<td>Used to construct a ridged case with sufficient insulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76290-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger</td>
			<td>Omega Engineering</td>
			<td>HH506A</td>
			<td>Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipette&#160;</td>
			<td>Ranin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater 
			with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2&#34; Wide, 100W</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3619K32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Sea Bioassay Mix</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>CM2B</td>
			<td>Use to make aritifical seawater&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denraster excentricus</td>
			<td>M-Rep&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sand dollars from California&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Connects to water bath and used to cool one end of the block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2&#34; thick 8&#34; x 8&#34;&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86825K953</td>
			<td>Machined to 2&#34; x 6&#34; x 8&#34; with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4530K121</td>
			<td>Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Can be used in place of the lab-grade water bath&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example with larval sand dollar&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89202-386</td>
			<td>Can be replaced with an aquarium chiller&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76019-014</td>
			<td>If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh filter</td>
			<td>&#160;Self made</td>
			<td></td>
			<td>Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2&#34; PVC tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (0.35 M)&#160;</td>
			<td>Millpore-Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R statistical software.&#160;</td>
			<td>The R Project for Statistical Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-346</td>
			<td>Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K65</td>
			<td>Adjust to match the chiller and block used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoo Med Repti Temp Rheostat</td>
			<td>Chewy.com</td>
			<td></td>
			<td>Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermal limits determination for zooplankton using a heat block

I limiti termici e l'ampiezza sono stati ampiamente utilizzati per prevedere la distribuzione delle specie. Mentre la temperatura globale continua a salire, capire come cambia il limite termico con l'acclimatazione e come varia tra le fasi della vita e le popolazioni è vitale per determinare la vulnerabilità delle specie al riscaldamento futuro. La maggior parte degli organismi marini ha cicli di vita complessi che includono i primi stadi planctonici. Mentre quantificare il limite termico di questi piccoli stadi iniziali di sviluppo (da decine a centinaia di micron) aiuta a identificare i colli di bottiglia dello sviluppo, questo processo può essere difficile a causa delle piccole dimensioni degli organismi bersaglio, del grande spazio richiesto al banco e degli elevati costi iniziali di fabbricazione. Qui viene presentata una configurazione orientata verso piccoli volumi (da ml a decine di ml). Questa configurazione combina componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Vengono inoltre presentate le specifiche di produzione della configurazione, nonché le procedure per introdurre ed enumerare individui vivi rispetto a quelli morti e calcolare la temperatura letale.

L'obiettivo di questo protocollo è determinare il limite termico superiore dello zooplancton. Per fare ciò, è necessario un gradiente termico stabile e lineare. La configurazione proposta è stata in grado di generare un gradiente termico compreso tra 14 °C e 40 °C impostando la temperatura del bagno d'acqua a 8 °C e il riscaldatore a 39 °C (Figura 2A). Il gradiente di temperatura può essere ridotto e spostato modificando i valori finali. È stato inoltre generato un gradiente termic...

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Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block

Il presente protocollo illustra l'uso di componenti disponibili in commercio per generare un gradiente termico stabile e lineare. Tale gradiente può quindi essere utilizzato per determinare il limite termico superiore degli organismi planctonici, in particolare delle larve di invertebrati.

Determinazione dei limiti termici per lo zooplancton utilizzando un blocco termico

Thermal limits and breadth have been widely used to predict species distribution. As the global temperature continues to rise, understanding how thermal ...

Poiché le temperature globali continuano ad aumentare, quantificare i limiti termici e la relazione con l'acclimatazione e l'ontogenesi sono vitali per determinare la vulnerabilità delle specie al riscaldamento futuro. Per gli organismi marini con storie di vita complesse, determinare i limiti termici può essere logisticamente impegnativo. Questo protocollo introduce un piccolo ingombro, un metodo facile da costruire per stimare le temperature critiche di piccoli organismi planctonici.Mentre il metodo è stato sviluppato per plancton piccolo, di dimensioni inferiori a un millimetro, può essere adottato per organismi marini più grandi che si inserirebbero in fiale di scintillazione di circa 50 millilitri di volume. Inizia collegando il riscaldatore a strisce al reostato. Praticare 60 fori in una griglia di sei per 10 dimensioni per preparare il blocco di alluminio di una dimensione di 20,3 per 15,2 per cinque centimetri e assicurarsi che i fori siano distanziati di due centimetri dal centro al centro in entrambe le direzioni.Praticare due fori aggiuntivi tra la prima e la seconda colonna e la nona e la 10a colonna, in base alle dimensioni delle sonde del regolatore di temperatura. Per mantenere gli elementi in posizione e isolare il blocco termico completato, costruire una custodia da fogli acrilici trasparenti, assicurandosi di applicare due strati sul retro dell'elemento riscaldante. Nell'assemblaggio finale, applicare la pasta termica per massimizzare la conduttanza termica dall'elemento riscaldante nel blocco e dal blocco all'elemento di raffreddamento.Collegare il bagno d'acqua con tubi Tygon e inserire la sonda del termostato nei fori sul lato del blocco di alluminio. In tutti i fori fresati, posizionare tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri, riempiti con acqua di rubinetto fino all'orlo. Accendere il regolatore di temperatura e impostare la temperatura di arresto del riscaldamento della sonda da uno a 35-37 gradi Celsius e la sonda da due a 21,5-22,5 gradi Celsius.Ruotare il reostato per accendere l'elemento riscaldante e impostarlo su medio. Accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del refrigeratore a 15 gradi Celsius. Utilizzando una termocoppia con un elettrodo di tipo K, controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga ogni 10 minuti successivi.Regolare i valori dei punti finali modificando le impostazioni del regolatore di temperatura e del bagno d'acqua in base alle esigenze. Accendere il bagno d'acqua e il riscaldatore di ricircolo e impostarli rispettivamente su 15 gradi Celsius e 37 gradi Celsius, per generare un gradiente di temperatura da 19,5 gradi Celsius a 37 gradi Celsius. Una volta posizionati i tubi della microcentrifuga in fori fresati e raggiunta la temperatura del blocco termico, controllare la temperatura all'interno di ogni tubo di microcentrifuga utilizzando una termocoppia con elettrodo di tipo K.E annota queste temperature. Riempire un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri con acqua di mare, filtrato attraverso una maglia da 0,45 micrometri. Concentrare la coltura dell'organismo in studio con il filtraggio inverso in modo che gli organismi rimangano sul fondo del becherRisciacquare la coltura concentrata con acqua di mare filtrata e ripetere ancora una volta il filtraggio inverso per concentrare il campione. Contare i piccoli organismi planctonici al microscopio da dissezione e trasferire un numero noto di organismi in provette di microcentrifuga riempite a metà utilizzando una pipetta pasteur di vetro. Ora aggiungi acqua di mare filtrata fino a quando il volume finale in questi tubi raggiunge un millilitro.Ora posiziona questi tubi a coppie nel blocco riscaldante, partendo dall'estremità fredda per consentire agli organismi di riscaldarsi gradualmente fino alla temperatura sperimentale desiderata. Attendere 10 minuti e spostare le coppie di tubi di microcentrifuga nei fori adiacenti con temperature più calde. Posizionare ulteriori coppie di tubi di microcentrifuga in ogni fila all'estremità fredda e continuare a spostarli verso l'estremità più calda a coppie.Una volta riempito l'intero blocco, incubarlo per due ore alla temperatura designata. Alla fine del periodo di incubazione, misurare la temperatura in ciascun tubo e annotarla. Quindi trasferire tutti i tubi ai supporti pre-etichettati e incubarli a una temperatura predeterminata per un'ora per consentire il recupero.Per enumerare la porzione di organismo vivo, trasferire il contenuto di una singola provetta di microcentrifuga in una capsula di Petri da 35 millimetri utilizzando una pipetta di vetro. Sotto un microscopio da dissezione, conta gli organismi vivi e morti e annota i numeri. Il numero osservato di organismi dovrebbe corrispondere all'organismo originariamente preso.In caso contrario, controllare il lato dei tubi di micro-centrifuga e della capsula di Petri, Generare una tabella dati in formato CSV con le intestazioni che raggruppano la variabile di interesse, la temperatura del tubo in gradi Celsius, il numero di individui vivi e il numero di individui morti. Per adattare i dati a una regressione logistica, utilizzare un modello lineare generalizzato con una distribuzione binomiale. Per eseguire il modello, digitare source e utilizzare il file R, modelloop.r.Calcolare i valori predittivi a cui il 50% degli individui è sopravvissuto, per determinare il limite termico superiore mediano. Utilizzando questo protocollo, è stata misurata la sopravvivenza dei dollari di sabbia larvale, che era in un intervallo di temperatura compreso tra 19 e 37 gradi Celsius, a due, quattro e sei giorni dopo la fecondazione. Con lo sviluppo dei dollari di sabbia larvale, il limite termico superiore è aumentato da 28,6 gradi Celsius a due giorni dopo la fecondazione, a 28,8 gradi Celsius a quattro giorni dopo la fecondazione e circa 29 gradi Celsius a sei giorni dopo la fecondazione.I tempi di incubazione e recupero sono specifici della specie. È importante condurre un test preliminare per garantire che la tempistica selezionata produca una stima affidabile dal vivo rispetto ai morti.

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