Name: thermal limits determination for zooplankton using a heat block
Uploaded: 2022-11-18T14:50:00
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Este trabalho é apoiado pelo Fundo de Pesquisa da Faculdade do Swarthmore College [KC] e pela Robert Reynolds e Lucinda Lewis '70 Summer Research Fellowship para BJ.

1. Fabricação do bloco de calor
<ol><li>Ligue o aquecedor de tiras de 120 V e 100 W ao reostato (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Prepare o bloco de alumínio de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pol x 5 pol x 2 pol) perfurando 60 furos em uma grade de 6 x 10 (consulte Tabela de Materiais). Certifique-se de que os orifícios estão espaçados 2 cm de centro para centro em ambas as direções. Cada um deve ter 1,1 cm de diâmetro e 4,2 cm de profundidade (<strong class="...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Garc&#237;a, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temperature+alter+the+relationship+between+biodiversity+and+ecosystem+functioning.">Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).</li><li>Sinclair, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+predict+ectotherm+responses+to+climate+change+using+thermal+performance+curves+and+body+temperatures.">Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures.</a> Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+history+and+critique.">The critical thermal maximum: history and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Bennett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+critical+thermal+limits+of+life+on+Earth.">The evolution of critical thermal limits of life on Earth.</a> Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).</li><li>Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+and+the+global+redistribution+of+animals.">Thermal tolerance and the global redistribution of animals.</a> Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).</li><li>Deutsch, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impacts+of+climate+warming+on+terrestrial+ectotherms+across+latitude.">Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).</li><li>Collin, R., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+urchin+Lytechinus+variegatus+lives+close+to+the+upper+thermal+limit+for+early+development+in+a+tropical+lagoon.">The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon.</a> Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).</li><li>Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+thermal+sensitivities+among+different+life+stages+of+the+pulmonate+limpet+Siphonaria+japonica.">Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica.</a> Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).</li><li>Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+temperature+and+salinity+on+early+life+stages+of+the+sea+urchin+Heliocidaris+crassispina.">Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina.</a> Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).</li><li>Strathmann, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+larva+of+marine+invertebrates.">Culturing larva of marine invertebrates.</a> Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).</li><li>Stillman, J. H., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+the+upper+thermal+tolerance+limits+of+Eastern+Pacific+porcelain+crabs,+Genus+Petrolisthes:+Influences+of+latitude,+vertical+Zonation,+acclimation,+and+phylogeny.">A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).</li><li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+patterns+of+thermal+tolerance+and+phenotypic+plasticity+with+population+genetics+to+improve+understanding+of+vulnerability+to+warming+in+a+widespread+copepod.">Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod.</a> Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).</li><li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+differentiation+underlies+seasonal+variation+in+thermal+tolerance,+body+size,+and+plasticity+in+a+short-lived+copepod.">Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod.</a> Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).</li><li>Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+potential+for+adaptation+to+climate+change+in+a+broadly+distributed+marine+crustacean.">Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).</li><li>Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+parental+effects+confers+rapid+larval+thermal+tolerance+in+the+estuarine+anemone+Nematostella+vectensis.">Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis.</a> Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).</li><li>Sewell, M. A., Young, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+limits+to+fertilization+and+early+development+in+the+tropical+sea+urchin+Echinometra+lucunter.">Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).</li><li>Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+larvae+of+Pollicipes+elegans,+a+marine+species+with+an+antitropical+distribution.">Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution.</a> Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).</li><li>Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+in+place+and+moving+in+space:+contrasting+larval+thermal+sensitivity+explains+distributional+changes+of+sympatric+sea+urchin+species+to+habitat+warming.">Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming.</a> Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).</li><li>Zippay, M. L., Hofmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+tolerances+across+latitudes:+thermal+sensitivity+of+larval+marine+snails+(Nucella+spp).">Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp).</a> Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).</li><li>Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+early+development+predicts+the+realized+thermal+niche+in+marine+ectotherms.">Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms.</a> Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">R: A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2021).</li><li>Venables, W. N., Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).</li><li>Fumo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextualizing+marine+heatwaves+in+the+southern+California+bight+under+anthropogenic+climate+change.">Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change.</a> Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).</li><li>Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+median+lethal+concentration+values+using+confidence+interval+overlap+or+ratio+tests.">Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).</li><li>Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+upper+thermal+limits+to+acute+and+chronic+temperature+variation+in+Manduca+sexta+larvae.">Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).</li><li>Kuo, E. S. L., Sanford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+in+the+upper+thermal+limits+of+an+intertidal+snail:+implications+for+climate+envelope+models.">Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models.</a> Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).</li><li>Hammond, L. M., Hofmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+Strongylocentrotus+purpuratus+early+life+history+stages:+mortality,+stress-induced+gene+expression+and+biogeographic+patterns.">Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns.</a> Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).</li><li>Sasaki, M., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+copepod+thermal+tolerance.">Global patterns in copepod thermal tolerance.</a> Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).</li></ol>

Este protocolo fornece uma abordagem acessível e personalizável para determinar os limites térmicos de pequenos organismos de plâncton através da exposição térmica aguda. O design de 10 furos e os endpoints de temperatura flexíveis, controlados pelo banho-maria na extremidade inferior e pelo aquecedor na extremidade superior, permitem determinar o LT50 com precisão. Usando essa abordagem, uma diferença no limite térmico que é de <1 °C pôde ser detectada (Figura 3). ...

A tolerância térmica é fundamental para a sobrevivência e função dos organismos 1,2. À medida que o planeta continua a aquecer devido às emissões antropogénicas de carbono, está a ser dada cada vez mais atenção à determinação e aplicação de limites térmicos3. Vários desfechos, como mortalidade, falha no desenvolvimento e perda de mobilidade, têm sido utilizados para determinar os limites térmicos superiores e inferiores4. Esses limites térmicos são frequentemente considerados um proxy para o nicho térmico de um organismo. Essas informações, por sua vez, são utilizadas para identificar espécies mais vulneráveis ao aquecimento global, bem como prever a distribuição futura de espécies e as interações resultantes das espécies 3,5,6,7. No entanto, determinar limites térmicos, especialmente para pequenos organismos planctônicos, pode ser um desafio.
Para organismos planctônicos, particularmente os estágios larvais de invertebrados marinhos, o limite térmico pode ser determinado através da exposição crônica. A exposição crônica é alcançada pela criação de larvas a várias temperaturas ao longo de dias a semanas e pela determinação da temperatura na qual a sobrevivência larval e/ou a taxa de desenvolvimento reduzem 8,9,10. No entanto, esta abordagem é bastante demorada e requer grandes incubadoras e experiência na criação de larvas (ver referência11 para uma boa introdução à cultura de larvas de invertebrados marinhos).
Alternativamente, a exposição aguda ao estresse térmico pode ser usada para determinar os limites térmicos. Muitas vezes, essa abordagem de determinação envolve a colocação de pequenos frascos com larvas em banhos secos com temperatura controlada 12,13,14, alavancando funções de gradiente térmico em termocicladores de PCR 15,16 ou colocando frascos de vidro/tubos de microcentrífuga ao longo de um gradiente térmico gerado pelo aquecimento e resfriamento aplicados nas extremidades de grandes blocos de alumínio com orifícios nos quais os frascos se encaixam confortavelmente 17, 18,19. Banhos secos típicos geram uma única temperatura; portanto, várias unidades devem ser operadas simultaneamente para avaliar o desempenho em uma faixa de temperaturas. Os termocicladores geram um gradiente, mas acomodam apenas um pequeno volume de amostra (120 μL) e requerem manipulações cuidadosas. Semelhante aos termocicladores, grandes blocos de alumínio criam gradientes de temperatura lineares e estáveis. Ambas as abordagens podem ser acopladas à regressão logística ou probit para calcular a temperatura letal para 50% por cento da população (LT50)12,20,21. No entanto, os blocos de alumínio utilizados tinham ~ 100 cm de comprimento; esse tamanho demanda um grande espaço de laboratório e acesso a fresadoras especializadas em controle numérico por computador para perfurar os furos. Juntamente com o uso de dois banhos de água de grau de pesquisa para manter a temperatura alvo, o custo financeiro de montagem da configuração é alto.
Portanto, este trabalho tem como objetivo desenvolver um meio alternativo para gerar um gradiente de temperatura estável e linear com peças comercialmente disponíveis. Tal produto deve ter uma pegada pequena e deve ser capaz de ser facilmente utilizado para experiências de exposição ao stress térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo é desenvolvido com zooplâncton que tem <1 mm de tamanho como organismos-alvo e, assim, foi otimizado para o uso de um tubo microcentrífugo de 1,5 ou 2 mL. Organismos de estudo maiores exigirão recipientes maiores do que os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL usados e furos ampliados nos blocos de alumínio.
Além de tornar o aparato experimental mais acessível, este trabalho visa simplificar o pipeline de processamento de dados. Embora o software estatístico comercial forneça rotinas para calcular o LT50 usando regressão logística ou probit, o custo de licenciamento não é trivial. Portanto, um script fácil de usar que se baseia no programa estatístico de código aberto R22 tornaria a análise de dados mais acessível.
Este protocolo mostra como um bloco de calor compacto pode ser fabricado com peças comercialmente disponíveis e ser aplicado para expor o zooplâncton (larvas do Dendraster excentricus) ao estresse térmico agudo para determinar seu limite térmico superior.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m membrane filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74300-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189;&#8221; Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K266</td>
			<td>Used to construct a ridged case with sufficient insulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76290-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger</td>
			<td>Omega Engineering</td>
			<td>HH506A</td>
			<td>Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipette&#160;</td>
			<td>Ranin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater 
			with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2&#34; Wide, 100W</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3619K32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Sea Bioassay Mix</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>CM2B</td>
			<td>Use to make aritifical seawater&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denraster excentricus</td>
			<td>M-Rep&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sand dollars from California&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Connects to water bath and used to cool one end of the block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2&#34; thick 8&#34; x 8&#34;&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86825K953</td>
			<td>Machined to 2&#34; x 6&#34; x 8&#34; with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4530K121</td>
			<td>Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Can be used in place of the lab-grade water bath&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example with larval sand dollar&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89202-386</td>
			<td>Can be replaced with an aquarium chiller&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76019-014</td>
			<td>If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh filter</td>
			<td>&#160;Self made</td>
			<td></td>
			<td>Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2&#34; PVC tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (0.35 M)&#160;</td>
			<td>Millpore-Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R statistical software.&#160;</td>
			<td>The R Project for Statistical Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-346</td>
			<td>Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K65</td>
			<td>Adjust to match the chiller and block used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoo Med Repti Temp Rheostat</td>
			<td>Chewy.com</td>
			<td></td>
			<td>Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermal limits determination for zooplankton using a heat block

Limites térmicos e amplitude têm sido amplamente utilizados para prever a distribuição de espécies. À medida que a temperatura global continua a subir, entender como o limite térmico muda com a aclimatação e como ele varia entre os estágios da vida e as populações é vital para determinar a vulnerabilidade das espécies ao aquecimento futuro. A maioria dos organismos marinhos tem ciclos de vida complexos que incluem estágios planctônicos iniciais. Embora quantificar o limite térmico desses pequenos estágios iniciais de desenvolvimento (dezenas a centenas de mícrons) ajude a identificar gargalos de desenvolvimento, esse processo pode ser desafiador devido ao pequeno tamanho dos organismos-alvo, à grande necessidade de espaço de bancada e ao alto custo inicial de fabricação. Aqui, uma configuração voltada para pequenos volumes (mL a dezenas de mL) é apresentada. Esta configuração combina componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. As especificações de produção da configuração, bem como os procedimentos para introduzir e enumerar indivíduos vivos versus mortos e calcular a temperatura letal, também são apresentados.

O objetivo deste protocolo é determinar o limite térmico superior do zooplâncton. Para isso, é necessário um gradiente térmico estável e linear. A configuração proposta foi capaz de gerar um gradiente térmico variando de 14 °C a 40 °C, ajustando a temperatura do banho-maria para 8 °C e o aquecedor para 39 °C (Figura 2A). O gradiente de temperatura pode ser estreitado e deslocado alterando os valores de ponto de extremidade. Um gradiente térmico com uma faixa mais estreita (19 ...

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Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block

O presente protocolo ilustra o uso de componentes comercialmente disponíveis para gerar um gradiente térmico estável e linear. Tal gradiente pode então ser usado para determinar o limite térmico superior de organismos planctônicos, particularmente larvas de invertebrados.

Determinação de limites térmicos para zooplâncton usando um bloco de calor

Thermal limits and breadth have been widely used to predict species distribution. As the global temperature continues to rise, understanding how thermal ...

À medida que as temperaturas globais continuam a subir, quantificar os limites térmicos e a relação com a aclimatação e a ontogenia são vitais para determinar a vulnerabilidade das espécies ao aquecimento futuro. Para organismos marinhos com histórias de vida complexas, determinar limites térmicos pode ser logisticamente desafiador. Este protocolo introduz um método de pegada pequena e fácil de construir para estimar temperaturas críticas de pequenos organismos planctônicos.Embora o método tenha sido desenvolvido para plâncton pequeno e de tamanho inferior a um milímetro, ele pode ser adotado para organismos marinhos maiores que caberiam em frascos de cintilação de aproximadamente 50 mililitros de volume. Comece conectando o aquecedor de tiras ao reostato. Faça 60 furos em uma grade de seis por 10 de tamanho para preparar o bloco de alumínio de um tamanho de 20,3 por 15,2 por cinco centímetros e certifique-se de que os furos sejam espaçados dois centímetros de centro a centro em ambas as direções.Faça dois furos adicionais entre a primeira e a segunda coluna e a nona e a 10ª coluna, correspondendo ao tamanho das sondas controladoras de temperatura. Para manter os elementos no lugar e isolar o bloco de calor completo, construa uma caixa a partir de folhas de acrílico transparente, garantindo a aplicação de duas camadas na parte de trás do elemento de aquecimento. Na montagem final, aplique pasta térmica para maximizar a condutância térmica do elemento de aquecimento para o bloco e do bloco para o elemento de resfriamento.Conecte o banho-maria com a tubulação Tygon e insira a sonda do termostato nos orifícios na lateral do bloco de alumínio. Em todos os orifícios fresados, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, cheios de água da torneira até a borda. Ligue o controlador de temperatura e defina a temperatura de aquecimento de parada da sonda um para 35 a 37 graus Celsius e a sonda dois para 21,5 a 22,5 graus Celsius.Gire o reostato para ligar o elemento de aquecimento e defina-o como médio. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura do resfriador para 15 graus Celsius. Usando um termopar com um eletrodo do tipo K, verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga a cada 10 minutos depois.Ajuste os valores dos pontos finais alterando as configurações do controlador de temperatura e do banho-maria, conforme necessário. Ligue o banho de água recirculante e o aquecedor e defina-os para 15 graus Celsius e 37 graus Celsius, respectivamente, para gerar um gradiente de temperatura de 19,5 graus Celsius a 37 graus Celsius. Uma vez que os tubos de microcentrífuga são colocados em orifícios fresados e a temperatura do bloco de calor é atingida, verifique a temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga usando um termopar com um eletrodo do tipo K.E anote essas temperaturas. Encha um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com água do mar, filtrada através de uma malha de 0,45 micrômetro. Concentrar a cultura do organismo em estudo com filtragem reversa para que os organismos permaneçam no fundo do copo.Enxaguar a cultura concentrada com água do mar filtrada e repetir a filtragem reversa mais uma vez para concentrar a amostra. Conte os pequenos organismos planctônicos sob um microscópio de dissecação e transfira um número conhecido de organismos para tubos de microcentrífuga meio cheios usando uma pipeta de pasteur de vidro. Agora adicione água do mar filtrada até que o volume final nesses tubos atinja um mililitro.Agora coloque esses tubos em pares no bloco de aquecimento, a partir da extremidade fria para permitir que os organismos se aqueçam gradualmente até a temperatura experimental desejada. Aguarde 10 minutos e mova os pares de tubos de microcentrífuga para os furos perfurados adjacentes com temperaturas mais quentes. Coloque pares adicionais de tubos de microcentrífuga em cada fileira na extremidade fria e continue a deslocá-los para a extremidade mais quente em pares.Uma vez que todo o bloco esteja cheio, incube-o por duas horas na temperatura designada. No final do período de incubação, meça a temperatura em cada tubo e anote-a. Em seguida, transfira todos os tubos para os suportes pré-rotulados e incube-os a uma temperatura predeterminada por uma hora para permitir a recuperação.Para enumerar a porção de organismo vivo, transfira o conteúdo de um tubo de microcentrífuga individual em uma placa de Petri de 35 milímetros usando uma pipeta de vidro. Sob um microscópio de dissecação, conte os organismos vivos e mortos e anote os números. O número observado de organismos deve corresponder ao organismo originalmente tomado.Se isso não acontecer, verifique o lado dos tubos de microcentrífuga e placa de Petri, Gere uma tabela de dados em formato CSV com os cabeçalhos agrupando a variável de interesse, a temperatura do tubo em graus Celsius, o número de indivíduos vivos e o número de indivíduos mortos. Para ajustar os dados com uma regressão logística, use um modelo linear generalizado com uma distribuição binomial. Para executar o modelo, digite source e use o arquivo R, modelloop.r.Calcule os valores preditores nos quais 50% dos indivíduos sobreviveram, para determinar o limite térmico superior mediano. Usando este protocolo, a sobrevivência de larvas de areia dólares foi medida, que foi através de uma faixa de temperatura de 19 a 37 graus Celsius, em dois, quatro e seis dias após a fertilização. À medida que os dólares de areia larval se desenvolveram, o limite térmico superior aumentou de 28,6 graus Celsius em dois dias após a fertilização, para 28,8 graus Celsius em quatro dias após a fertilização e aproximadamente 29 graus Celsius em seis dias após a fertilização.Os tempos de incubação e recuperação são específicos da espécie. É importante realizar um teste preliminar para garantir que o tempo selecionado produza uma estimativa viva versus morta confiável.

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