Name: thermal limits determination for zooplankton using a heat block
Uploaded: 2022-11-18T14:50:00
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Este trabajo es apoyado por el Fondo de Investigación de la Facultad del Swarthmore College [KC] y la beca de investigación de verano Robert Reynolds y Lucinda Lewis '70 para BJ.

1. Fabricación del bloque térmico
<ol><li>Conecte el calentador de tiras de 120 V y 100 W al reóstato (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Prepare el bloque de aluminio de 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm (8 pulgadas x 5 pulgadas x 2 pulgadas) perforando 60 agujeros en una cuadrícula de 6 x 10 (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que los orificios estén espaciados 2 cm de centro a centro en ambas direcciones. Cada uno debe tener 1,1 cm de diámetro y 4...

<ol>
	<li>Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+variation,+thermal+extremes+and+the+physiological+performance+of+individuals.">Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals.</a> Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).</li><li>Garc&#237;a, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+temperature+alter+the+relationship+between+biodiversity+and+ecosystem+functioning.">Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).</li><li>Sinclair, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+predict+ectotherm+responses+to+climate+change+using+thermal+performance+curves+and+body+temperatures.">Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures.</a> Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).</li><li>Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+thermal+maximum:+history+and+critique.">The critical thermal maximum: history and critique.</a> Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).</li><li>Bennett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+critical+thermal+limits+of+life+on+Earth.">The evolution of critical thermal limits of life on Earth.</a> Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).</li><li>Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+and+the+global+redistribution+of+animals.">Thermal tolerance and the global redistribution of animals.</a> Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).</li><li>Deutsch, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impacts+of+climate+warming+on+terrestrial+ectotherms+across+latitude.">Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).</li><li>Collin, R., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sea+urchin+Lytechinus+variegatus+lives+close+to+the+upper+thermal+limit+for+early+development+in+a+tropical+lagoon.">The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon.</a> Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).</li><li>Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+thermal+sensitivities+among+different+life+stages+of+the+pulmonate+limpet+Siphonaria+japonica.">Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica.</a> Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).</li><li>Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+effects+of+temperature+and+salinity+on+early+life+stages+of+the+sea+urchin+Heliocidaris+crassispina.">Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina.</a> Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).</li><li>Strathmann, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+larva+of+marine+invertebrates.">Culturing larva of marine invertebrates.</a> Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).</li><li>Stillman, J. H., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+the+upper+thermal+tolerance+limits+of+Eastern+Pacific+porcelain+crabs,+Genus+Petrolisthes:+Influences+of+latitude,+vertical+Zonation,+acclimation,+and+phylogeny.">A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny.</a> Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).</li><li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+patterns+of+thermal+tolerance+and+phenotypic+plasticity+with+population+genetics+to+improve+understanding+of+vulnerability+to+warming+in+a+widespread+copepod.">Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod.</a> Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).</li><li>Sasaki, M. C., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+differentiation+underlies+seasonal+variation+in+thermal+tolerance,+body+size,+and+plasticity+in+a+short-lived+copepod.">Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod.</a> Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).</li><li>Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+potential+for+adaptation+to+climate+change+in+a+broadly+distributed+marine+crustacean.">Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).</li><li>Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+parental+effects+confers+rapid+larval+thermal+tolerance+in+the+estuarine+anemone+Nematostella+vectensis.">Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis.</a> Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).</li><li>Sewell, M. A., Young, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+limits+to+fertilization+and+early+development+in+the+tropical+sea+urchin+Echinometra+lucunter.">Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).</li><li>Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+larvae+of+Pollicipes+elegans,+a+marine+species+with+an+antitropical+distribution.">Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution.</a> Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).</li><li>Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staying+in+place+and+moving+in+space:+contrasting+larval+thermal+sensitivity+explains+distributional+changes+of+sympatric+sea+urchin+species+to+habitat+warming.">Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming.</a> Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).</li><li>Zippay, M. L., Hofmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+tolerances+across+latitudes:+thermal+sensitivity+of+larval+marine+snails+(Nucella+spp).">Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp).</a> Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).</li><li>Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+early+development+predicts+the+realized+thermal+niche+in+marine+ectotherms.">Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms.</a> Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).</li><li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">R: A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2021).</li><li>Venables, W. N., Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).</li><li>Fumo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextualizing+marine+heatwaves+in+the+southern+California+bight+under+anthropogenic+climate+change.">Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change.</a> Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).</li><li>Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+median+lethal+concentration+values+using+confidence+interval+overlap+or+ratio+tests.">Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).</li><li>Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+upper+thermal+limits+to+acute+and+chronic+temperature+variation+in+Manduca+sexta+larvae.">Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae.</a> Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).</li><li>Kuo, E. S. L., Sanford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographic+variation+in+the+upper+thermal+limits+of+an+intertidal+snail:+implications+for+climate+envelope+models.">Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models.</a> Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).</li><li>Hammond, L. M., Hofmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+tolerance+of+Strongylocentrotus+purpuratus+early+life+history+stages:+mortality,+stress-induced+gene+expression+and+biogeographic+patterns.">Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns.</a> Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).</li><li>Sasaki, M., Dam, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+patterns+in+copepod+thermal+tolerance.">Global patterns in copepod thermal tolerance.</a> Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).</li></ol>

Este protocolo proporciona un enfoque accesible y personalizable para determinar los límites térmicos de pequeños organismos de plancton a través de la exposición térmica aguda. El diseño de 10 orificios y los puntos finales de temperatura flexibles, controlados por el baño de agua en el extremo inferior y el calentador en el extremo superior, permiten determinar LT50 con precisión. Usando este enfoque, se podría detectar una diferencia en el límite térmico que es <1 ° C (Figu...

La tolerancia térmica es clave para la supervivencia y función de los organismos 1,2. A medida que el planeta continúa calentándose debido a las emisiones antropogénicas de carbono, se está prestando cada vez más atención a la determinación y aplicación de límites térmicos3. Se han utilizado varios criterios de valoración, como la mortalidad, la falta de desarrollo y la pérdida de movilidad, para determinar los límites térmicos superior e inferior4. Estos límites térmicos a menudo se consideran un proxy para el nicho térmico de un organismo. Esta información se utiliza a su vez para identificar especies que son más vulnerables al calentamiento global, así como para predecir la distribución futura de las especies y las interacciones resultantesentre especies 3,5,6,7. Sin embargo, determinar los límites térmicos, especialmente para pequeños organismos planctónicos, puede ser un desafío.
Para los organismos planctónicos, particularmente las etapas larvales de los invertebrados marinos, el límite térmico puede determinarse a través de la exposición crónica. La exposición crónica se logra criando larvas a varias temperaturas durante días o semanas y determinando la temperatura a la que la supervivencia larvaria y / o la tasa dedesarrollo reduce 8,9,10. Sin embargo, este enfoque requiere bastante tiempo y requiere grandes incubadoras y experiencia en la cría de larvas (consulte la referencia11 para una buena introducción al cultivo de larvas de invertebrados marinos).
Alternativamente, la exposición aguda al estrés térmico se puede utilizar para determinar los límites térmicos. A menudo, este enfoque de determinación implica colocar viales pequeños con larvas en baños secos con temperatura controlada 12,13,14, aprovechar las funciones de gradiente térmico en termocicladores de PCR 15,16, o colocar viales de vidrio / tubos de microcentrífuga a lo largo de un gradiente térmico generado por calentamiento y enfriamiento aplicados en los extremos de grandes bloques de aluminio con orificios en los que los viales encajan cómodamente 17, 18,19. Los baños secos típicos generan una sola temperatura; Por lo tanto, se deben operar varias unidades simultáneamente para evaluar el rendimiento en un rango de temperaturas. Los termocicladores generan un gradiente, pero solo acomodan un pequeño volumen de muestra (120 μL) y requieren manipulaciones cuidadosas. Al igual que los termocicladores, los grandes bloques de aluminio crean gradientes de temperatura lineales y estables. Ambos enfoques pueden combinarse con regresión logística o probit para calcular la temperatura letal para el 50% por ciento de la población (LT50)12,20,21. Sin embargo, los bloques de aluminio utilizados tenían ~ 100 cm de largo; Este tamaño exige un gran espacio de laboratorio y acceso a fresadoras especializadas de control numérico por computadora para perforar los agujeros. Junto con el uso de dos baños de agua de grado de investigación para mantener la temperatura objetivo, el costo financiero de ensamblar la configuración es alto.
Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo desarrollar un medio alternativo para generar un gradiente de temperatura estable y lineal con piezas disponibles comercialmente. Dicho producto debe tener una huella pequeña y debe poder usarse fácilmente para experimentos de exposición al estrés térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo se desarrolla con zooplancton que tiene un tamaño de <1 mm como organismos objetivo, y por lo tanto, se optimizó para el uso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 o 2 ml. Los organismos de estudio más grandes requerirán contenedores más grandes que los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml utilizados y orificios agrandados en los bloques de aluminio.
Además de hacer que el aparato experimental sea más accesible, este trabajo tiene como objetivo simplificar la tubería de procesamiento de datos. Si bien el software estadístico comercial proporciona rutinas para calcular LT50 utilizando regresión logística o probit, el costo de la licencia no es trivial. Por lo tanto, un script fácil de usar que se basa en el programa estadístico de código abierto R22 haría que el análisis de datos fuera más accesible.
Este protocolo muestra cómo se puede fabricar un bloque térmico compacto con piezas disponibles comercialmente y aplicarse para exponer el zooplancton (larvas del dólar de arena Dendraster excentricus) a un estrés térmico agudo para determinar su límite térmico superior.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m membrane filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>74300-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189;&#8221; Acrylic sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K266</td>
			<td>Used to construct a ridged case with sufficient insulation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76290-420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger</td>
			<td>Omega Engineering</td>
			<td>HH506A</td>
			<td>Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic pipette&#160;</td>
			<td>Ranin&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater 
			with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2&#34; Wide, 100W</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>3619K32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Sea Bioassay Mix</td>
			<td>Pentair</td>
			<td>CM2B</td>
			<td>Use to make aritifical seawater&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denraster excentricus</td>
			<td>M-Rep&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Sand dollars from California&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope&#160;</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Connects to water bath and used to cool one end of the block.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2&#34; thick 8&#34; x 8&#34;&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>86825K953</td>
			<td>Machined to 2&#34; x 6&#34; x 8&#34; with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>4530K121</td>
			<td>Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Can be used in place of the lab-grade water bath&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Example with larval sand dollar&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89202-386</td>
			<td>Can be replaced with an aquarium chiller&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76019-014</td>
			<td>If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh filter</td>
			<td>&#160;Self made</td>
			<td></td>
			<td>Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2&#34; PVC tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (0.35 M)&#160;</td>
			<td>Millpore-Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R statistical software.&#160;</td>
			<td>The R Project for Statistical Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-346</td>
			<td>Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing&#160;</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K65</td>
			<td>Adjust to match the chiller and block used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoo Med Repti Temp Rheostat</td>
			<td>Chewy.com</td>
			<td></td>
			<td>Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermal limits determination for zooplankton using a heat block

Los límites térmicos y la amplitud se han utilizado ampliamente para predecir la distribución de las especies. A medida que la temperatura global continúa aumentando, comprender cómo cambia el límite térmico con la aclimatación y cómo varía entre las etapas de la vida y las poblaciones es vital para determinar la vulnerabilidad de las especies al calentamiento futuro. La mayoría de los organismos marinos tienen ciclos de vida complejos que incluyen etapas planctónicas tempranas. Si bien cuantificar el límite térmico de estas pequeñas etapas tempranas del desarrollo (decenas a cientos de micras) ayuda a identificar los cuellos de botella del desarrollo, este proceso puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de los organismos objetivo, el gran requisito de espacio de banco y el alto costo de fabricación inicial. Aquí, se presenta una configuración que está orientada a volúmenes pequeños (ml a decenas de ml). Esta configuración combina componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. También se presentan las especificaciones de producción de la configuración, así como los procedimientos para introducir y enumerar individuos vivos versus muertos y calcular la temperatura letal.

El objetivo de este protocolo es determinar el límite térmico superior del zooplancton. Para ello, se necesita un gradiente térmico estable y lineal. La configuración propuesta fue capaz de generar un gradiente térmico que oscilaba entre 14 °C y 40 °C ajustando la temperatura del baño de agua a 8 °C y la del calentador a 39 °C (Figura 2A). El gradiente de temperatura se puede reducir y cambiar cambiando los valores del punto final. También se generó un gradiente térmico con un r...

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Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block

El presente protocolo ilustra el uso de componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. Dicho gradiente se puede utilizar para determinar el límite térmico superior de organismos planctónicos, particularmente larvas de invertebrados.

Determinación de los límites térmicos para el zooplancton utilizando un bloque de calor

Thermal limits and breadth have been widely used to predict species distribution. As the global temperature continues to rise, understanding how thermal ...

A medida que las temperaturas globales continúan aumentando, la cuantificación de los límites térmicos y la relación con la aclimatación y la ontogenia son vitales para determinar la vulnerabilidad de las especies al calentamiento futuro. Para los organismos marinos con historias de vida complejas, determinar los límites térmicos puede ser un desafío logístico. Este protocolo introduce un método de huella pequeña y fácil de construir para estimar las temperaturas críticas de pequeños organismos planctónicos.Si bien el método se desarrolló para plancton pequeño, de menos de un milímetro de tamaño, se puede adoptar para organismos marinos más grandes que cabrían en viales de centelleo de aproximadamente 50 mililitros de volumen. Comience cableando el calentador de tiras al reóstato. Perfore 60 agujeros en una cuadrícula de tamaño de seis por 10 para preparar el bloque de aluminio de un tamaño de 20.3 por 15.2 por cinco centímetros, y asegúrese de que los agujeros estén espaciados dos centímetros de centro a centro en ambas direcciones.Perfore dos orificios adicionales entre la primera y la segunda columna y la novena y 10ª columna, que coincidan con el tamaño de las sondas del controlador de temperatura. Para mantener los elementos en su lugar y aislar el bloque térmico completo, construya una caja con láminas de acrílico transparente, asegurándose de aplicar dos capas en la parte posterior del elemento calefactor. En el ensamblaje final, aplique pasta térmica para maximizar la conductancia térmica del elemento calefactor al bloque y del bloque al elemento refrigerante.Conecte el baño de agua con el tubo Tygon e inserte la sonda del termostato en los orificios en el lado del bloque de aluminio. En todos los orificios fresados, coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, llenos de agua del grifo hasta el borde. Encienda el controlador de temperatura y ajuste la temperatura de calentamiento de parada de la sonda uno a 35 a 37 grados centígrados, y la sonda dos a 21,5 a 22,5 grados centígrados.Gire el reóstato para encender el elemento calefactor y configúrelo en medio. Encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del enfriador a 15 grados centígrados. Usando un termopar con un electrodo tipo K, verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga cada 10 minutos después.Ajuste los valores de los puntos finales cambiando la configuración del controlador de temperatura y el baño de agua según sea necesario. Encienda el baño de agua de recirculación y el calentador y configúrelos a 15 grados centígrados y 37 grados centígrados respectivamente, para generar un gradiente de temperatura de 19,5 grados centígrados a 37 grados centígrados. Una vez que los tubos de microcentrífuga se colocan en orificios fresados y se alcanza la temperatura del bloque de calor, verifique la temperatura dentro de cada tubo de microcentrífuga utilizando un termopar con un electrodo tipo K.Y anote estas temperaturas. Llene un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con agua de mar, filtrada a través de una malla de 0,45 micrómetros. Concentrar el cultivo del organismo de estudio con filtrado inverso para que los organismos permanezcan en el fondo del vaso de precipitados.Enjuague el cultivo concentrado con agua de mar filtrada y repita el filtrado inverso una vez más para concentrar la muestra. Contar los pequeños organismos planctónicos bajo un microscopio de disección y transferir un número conocido de organismos a tubos de microcentrífuga medio llenos utilizando una pipeta pasteur de vidrio. Ahora agregue agua de mar filtrada hasta que el volumen final en estos tubos alcance un mililitro.Ahora coloque estos tubos en pares en el bloque de calentamiento, comenzando desde el extremo frío para permitir que los organismos se calienten gradualmente a la temperatura experimental deseada. Espere 10 minutos y mueva los pares de tubos de microcentrífuga a los orificios perforados adyacentes con temperaturas más cálidas. Coloque pares adicionales de tubos de microcentrífuga en cada fila en el extremo frío y continúe desplazándolos hacia el extremo más cálido en pares.Una vez que todo el bloque esté lleno, incubarlo durante dos horas a la temperatura designada. Al final del período de incubación, mida la temperatura en cada tubo y anótela. Luego transfiera todos los tubos a los soportes preetiquetados e incubarlos a una temperatura predeterminada durante una hora para permitir la recuperación.Para enumerar la porción del organismo vivo, transfiera el contenido de un tubo de microcentrífuga individual en una placa de Petri de 35 milímetros utilizando una pipeta de vidrio. Bajo un microscopio de disección, cuente los organismos vivos y muertos y anote los números. El número observado de organismos debe coincidir con el organismo tomado originalmente.Si no es así, compruebe el lado de los tubos de microcentrífuga y la placa de Petri, Genere una tabla de datos en formato CSV con las cabeceras agrupando variables de interés, la temperatura del tubo en grados centígrados, el número de individuos vivos y el número de individuos muertos. Para ajustar los datos con una regresión logística, utilice un modelo lineal generalizado con una distribución binomial. Para ejecutar el modelo, escriba source y utilice el archivo R, modelloop.r.Calcular los valores predictores en los que sobrevivió el 50% de los individuos, para determinar el límite térmico superior medio. Usando este protocolo, se midió la supervivencia de los dólares de arena larval, que estaba en un rango de temperatura de 19 a 37 grados centígrados, a los dos, cuatro y seis días después de la fertilización. A medida que se desarrollaban los dólares de arena larval, el límite térmico superior aumentó de 28.6 grados centígrados a los dos días posteriores a la fertilización, a 28.8 grados centígrados a los cuatro días después de la fertilización, y aproximadamente 29 grados centígrados a los seis días después de la fertilización.Los tiempos de incubación y recuperación son específicos de cada especie. Es importante realizar una prueba preliminar para garantizar que el tiempo seleccionado produzca una estimación confiable de vivos versus muertos.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

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