Name: methods for studying uterine contributions to pregnancy establishment in an ovariectomized mouse model
Uploaded: 2023-04-07T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model at JoVE.com

Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et à l’IRIRIISS du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) du gouvernement australien. Ce travail a été soutenu par la subvention d’accès à la plateforme de la Faculté de médecine, des soins infirmiers et des sciences de la santé de l’Université Monash à A.L.W. (Winship-PAG18-0343) pour accéder à la plate-forme Monash Reproductive Services. A.L.W. est soutenu par le financement DECRA DE21010037 de l’Australian Research Council (ARC). J.N.H. et L.R.A. sont soutenus par une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien. L.R.A. est soutenu par une bourse d’excellence Monash. K.J.H. est soutenu par une bourse ARC Future FT190100265.

Tous les animaux ont été logés dans des installations à haute barrière à température contrôlée (laboratoire de recherche animale de l’Université Monash) avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau et un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Toutes les procédures ont été effectuées conformément à l’approbation du comité d’éthique de la plate-forme de recherche animale Monash (# 21908, 17971) et conformément au code de pratique du Conseil national de la santé et de la recherche médica...

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	<li>Szamatowicz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assisted+reproductive+technology+in+reproductive+medicine+-+Possibilities+and+limitations.">Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations.</a> Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).</li><li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertile+ground:+Human+endometrial+programming+and+lessons+in+health+and+disease.">Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease.</a> Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).</li><li>Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. 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Cet article fournit des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer OVX et de fournir des hormones exogènes pour les études axées sur la compréhension des contributions utérines à la grossesse et à la fertilité. Deux protocoles détaillés sont fournis sur deux applications expérimentales de ces méthodes, y compris la réalisation du transfert d’embryons et l’induction artificielle de la décidualisation.
Bien que la réalisation d’OVX puisse être difficile au d...

Avec l’utilisation croissante des technologies de procréation assistée au cours des dernières décennies, de nombreux obstacles à la conception ont été surmontés, permettant à de nombreux couples de fonder une famille malgré les problèmes de fertilité1. Les déficits ovocytaires ou spermatozoïdes peuvent souvent être contournés par fécondation in vitro ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes; Cependant, les problèmes liés à la réceptivité de l’utérus et de l’endomètre restent une « boîte noire » insaisissable du potentiel reproducteur2.
La grossesse est établie lorsqu’un embryon de haute qualité interagit avec succès avec un endomètre réceptif (muqueuse utérine). Les chances de réussite de la grossesse dans un cycle menstruel donné sont faibles, à environ 30%3,4. Parmi celles qui réussissent, seulement 50% à 60% avancent au-delà de 20 semaines de gestation, l’échec de l’implantation étant responsable de 75% des grossesses qui n’atteignent pas 20 semaines3. Malgré ces chiffres datant de la fin des années 1990, le domaine n’a pas encore surmonté les limites causées par un endomètre insuffisamment réceptif. Cela a entraîné une stagnation - et parfois une baisse - des taux de réussite de la FIV au cours des dernières années 5,6.
Les femmes souffrant d’infertilité inexpliquée ont souvent une fenêtre de réceptivité déplacée ou sont incapables d’atteindre la réceptivité pour des raisons inconnues. Récemment, le réseau de réceptivité de l’endomètre a été développé, qui évalue l’expression de centaines de gènes dans le but d’adapter le moment du transfert d’embryons à la fenêtre de réceptivité d’un individu 7,8,9. Cependant, le domaine manque encore de compréhension de la pathogenèse des complications de la grossesse qui se manifestent après la fin du processus d’implantation.
Le système reproducteur féminin est très dynamique et sous contrôle hormonal étroit. L’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) contrôle la libération de l’hormone lutéinisante et de l’hormone folliculo-stimulante, qui régulent les aspects du cycle ovarien, y compris la maturation des follicules et l’activité des œstrogènes et de la progestérone. À son tour, le cycle menstruel utérin est régulé par les œstrogènes et la progestérone10,11. Ainsi, l’étude des mécanismes biologiques utérins est compliquée par l’influence ovarienne. Par exemple, lorsque l’on étudie l’impact des thérapies anticancéreuses sur l’utérus, il peut être difficile de distinguer si un phénotype utérin observé (comme une perte de grossesse ou une acyclique menstruelle) est le résultat d’une insulte directe à l’utérus ou d’un effet consécutif de dommages aux ovaires.
Pour bien comprendre la fertilité, les contributions utérines à la grossesse doivent être caractérisées. Il est important de noter que cette compréhension doit s’étendre au-delà de la fonction utérine sous contrôle ovarien. Cela ne peut pas être étudié chez l’homme; Par conséquent, des modèles animaux sont souvent utilisés. En tant que telle, l’ovariectomie (OVX) est couramment utilisée pour permettre aux chercheurs de réguler les cycles œstraux des rongeurs (analogues au cycle menstruel) en fournissant des hormones exogènes. De plus, OVX permet d’étudier les réponses utérines indépendamment de l’influence ovarienne12. Cependant, si les hormones ne sont pas immédiatement fournies après OVX, un phénotype de ménopause finira par apparaître, ce qui doit être soigneusement examiné par les chercheurs.
OVX est fréquemment utilisé dans les modèles de rongeurs 13,14,15,16,17 et est relativement facile à réaliser après un entraînement adéquat. Les méthodes varient selon que l’ovaire seul ou l’ovaire et l’oviducte sont enlevés, ainsi que selon l’âge de l’animal (adultes, les animaux cyclistes ont des ovaires plus gros avec un corps jaune visible à leur surface, ce qui signifie que leurs ovaires sont plus faciles à visualiser). De même, de nombreuses méthodes de supplémentation hormonale existent, notamment les injections sous-cutanées14, les pastilles à libération lente 15, les minipompes osmotiques18 et la greffe ovarienne.
Dans cet article, des instructions détaillées sont fournies sur la façon d’effectuer une ovariectomie et de préparer trois types de supplémentation hormonale, y compris les injections sous-cutanées, les granulés à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Deux protocoles détaillés sont fournis pour les critères expérimentaux qui bénéficient d’OVX suivi d’une supplémentation en hormones exogènes (transfert d’embryons et décidualisation artificielle). Cet article traite des forces et des faiblesses de chaque approche dans le but de guider les chercheurs sur la façon de mener des études pour isoler les impacts sur l’utérus, en particulier dans les domaines de la grossesse et de la fertilité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ALZET 1002 mini osmotic pumps</td>
			<td>BioScientifica</td>
			<td>1002</td>
			<td>Delivers 0.25 &#181;L/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure - Embryo transfer).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALZET 1003D mini osmotic pumps</td>
			<td>BioScientifica</td>
			<td>1003D</td>
			<td>Delivers 1 &#181;L/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure - Artificial decidualization).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALZET Reflex 7 mm clips</td>
			<td>BioScientifica</td>
			<td>0009971</td>
			<td>Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALZET Reflex clip applicator</td>
			<td>BioScientifica</td>
			<td>0009974</td>
			<td>Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALZET Reflex clip remover</td>
			<td>BioScientifica</td>
			<td>0009976</td>
			<td>Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivicaine injection</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estradiol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Ilium</td>
			<td>NA</td>
			<td>Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Michel clips</td>
			<td>Daniels</td>
			<td>NS-000242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi purpose sealant</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-surgical embryo transfer (NSET) device</td>
			<td>ParaTechs</td>
			<td>60010</td>
			<td>Contains 6 mm speculum. Single use only.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0130</td>
			<td>Soluble in ethanol. Use for&#160; section 3 (Hormone preparation - subcutaneous injection) and&#160; section 4 (Hormone preparation - slow-release pellets)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7556</td>
			<td>Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation - osmotic mini pumps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refresh eye ointment</td>
			<td>Allergan</td>
			<td>NA</td>
			<td>42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>NA</td>
			<td>Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tubing</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>508-008</td>
			<td>Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm &#177;&#160; 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm &#177; 0.23 mm; wall 0.81 mm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sesame oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Silk sutures size 3-0</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>GS-832</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for studying uterine contributions to pregnancy establishment in an ovariectomized mouse model

Pour qu’une grossesse soit établie, un blastocyste viable doit interagir avec succès avec une muqueuse utérine réceptive (endomètre) pour faciliter l’implantation et la formation de placenta et permettre la poursuite de la grossesse. Les limites au succès de la grossesse causées par des anomalies embryonnaires sont bien connues et ont été largement surmontées au cours des dernières décennies avec l’essor de la fécondation in vitro (FIV) et des technologies de procréation assistée. Jusqu’à présent, cependant, le domaine n’a pas surmonté les limitations causées par un endomètre insuffisamment réceptif, ce qui entraîne une stagnation des taux de réussite de la FIV. Les fonctions ovarienne et endométriale sont étroitement liées, car les hormones produites par l’ovaire sont responsables de la cyclicité menstruelle de l’endomètre. En tant que tel, lors de l’utilisation de modèles de grossesse chez les rongeurs, il peut être difficile de déterminer si un résultat observé est dû à un déficit ovarien ou utérin. Pour surmonter cela, un modèle murin ovariectomisé a été développé avec transfert d’embryons ou décidualisation artificielle pour permettre l’étude des contributions spécifiques utérines à la grossesse. Cet article fournira des instructions sur la façon d’effectuer une ovariectomie et offrira un aperçu de diverses techniques pour fournir des hormones exogènes afin de soutenir une décidualisation artificielle ou une grossesse réussie après le transfert d’embryons de donneurs sains. Ces techniques comprennent l’injection sous-cutanée, les pastilles à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Les principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront discutés, ce qui permettra aux chercheurs de choisir le meilleur plan d’étude pour leur question de recherche spécifique.

Un modèle bien caractérisé de décidualisation artificielle est décrit dans ce document de protocole (figure 1A). Ici, les jeunes souris femelles adultes (âgées de 8 semaines) ont subi une ovariectomie chirurgicale comme décrit aux rubriques 1 et 2. Les souris ont ensuite été reposées pendant 2 semaines pour s’assurer que les hormones ovariennes endogènes se dissipaient avant d’être soutenues par des hormones exogènes comme décrit dans les sections 3-7...

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Methods for Studying Uterine Contributions to Pregnancy Establishment in an Ovariectomized Mouse Model

L’établissement de la grossesse est un processus dynamique impliquant une diaphonie embryonnaire et utérine complexe. Les contributions précises de l’environnement utérin maternel à ces processus restent un domaine de recherche actif. Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour aider à concevoir des modèles animaux in vivo pour répondre à ces questions de recherche.

Méthodes d’étude des contributions utérines à l’établissement de la grossesse dans un modèle murin ovariectomisé

For pregnancy to be established, a viable blastocyst must successfully interact with a receptive uterine lining (endometrium) to facilitate implantation ...

Il est donc difficile de séparer le rôle des influences hormonales utérines et ovariennes sur l’établissement de la grossesse, car les deux sont intimement liés. Ce protocole nous permet donc d’examiner directement les apports utérins. Bien que certaines de ces techniques comme l’ovariectomie soient assez invasives, elles sont relativement simples à exécuter après la pratique et la formation, ce qui les rend appropriées pour les chercheurs qui découvrent les modèles murins.Cette méthode peut donc être utilisée pour comprendre la régulation plus large de l’axe HPG, car les ovaires et l’utérus jouent un rôle important dans la régulation de cet axe. Si vous n’avez jamais pratiqué ces techniques auparavant, consultez l’équipe vétérinaire de votre institut pour obtenir de la formation et du soutien. Pour commencer, appliquez généreusement du lubrifiant pour les yeux sur une souris anesthésiée en le tamponnant doucement sur l’œil après avoir rasé une petite zone à la bosse sous l’intuition de la colonne vertébrale.Injectez 0,1 millilitre de carprofène par voie sous-cutanée dans la peau du cou. Testez si l’animal est anesthésié en lui pinçant l’orteil arrière et en vérifiant s’il a un réflexe. Ensuite, appliquez Betadine sur le site chirurgical.Ensuite, couvrez-le avec un champ chirurgical. À l’aide d’une pince à dents de rat, retirez la peau au niveau de l’intuition vers le haut et faites une incision longitudinale de cinq millimètres. Ensuite, à l’aide d’une pince émoussée, disséquez la peau loin de la couche musculaire sous-jacente d’un côté vers le rein.Identifiez le coussinet graisseux rénal, ovaire et ovarien à travers la paroi musculaire. Saisissez et soulevez la couche musculaire avec la pince. Ensuite, à l’aide de ciseaux, faites une incision de 0,5 à un centimètre de long et tirez le coussinet ovarien à travers l’incision avec une paire de pinces émoussées.Ensuite, à l’aide d’un porte-aiguille incurvé, serrez sous l’ovaire et l’oviducte à l’extrémité distale de la corne utérine et excisez l’ovaire avec des ciseaux. Après 30 secondes, retirez la pince et tamponnez avec de la gaze stérile. Pour fermer l’incision de la paroi musculaire, soulevez le haut de l’incision à l’aide d’une pince.Ensuite, attachez l’incision avec un nœud de chirurgien à l’aide de sutures en soie. Appliquez localement quelques gouttes de bupivacaïne à l’aide d’une seringue d’un millilitre sans fixation d’aiguille et tamponnez l’excès avec de la gaze stérile. Après avoir effectué de la même manière l’ovariectomie de l’autre côté, fermez l’incision cutanée en pressant les deux côtés de la peau ensemble et en appliquant quelques clips chirurgicaux de sept millimètres, laissant place à un gonflement de la plaie.Placez tout l’équipement nécessaire sur une feuille à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire ou de biosécurité de classe II et stérilisez aux UV pendant 20 minutes. Lavez le tube silastique à 100% de désinol et laissez-le sécher à l’air libre à l’intérieur de la hotte. Une fois sec, coupez le tube en segments d’un centimètre de long à l’aide d’un scalpel.Ensuite, pressez environ 200 microlitres de mastic dans une seringue sans piston. Replacez le piston et retirez une petite quantité de scellant. Appliquez le scellant à une extrémité du tube, en le lissant avec un doigt ganté.Et laissez le scellant sécher pendant la nuit ou sous la lumière UV pendant 30 minutes dans la hotte. Ensuite, versez la poudre de progestérone dans une boîte de Petri stérilisée. Versez la poudre en pastilles à l’aide d’une pince.Tapotez l’extrémité scellée de la pastille sur la surface de la hotte pour condenser la poudre. Scellez ensuite l’extrémité ouverte avec le scellant. Enveloppez la boîte de Petri contenant les granulés dans du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière.Environ 72 heures avant l’insertion sous-cutanée, activez les pastilles en les incubant dans du FCS dénudé au charbon de bois. La Dre Fiona Cousins, chercheuse scientifique en début de carrière à l’Institut Hudson de recherches médicales, fera la démonstration de cette procédure. Après l’amorçage hormonal des animaux avec des injections sous-cutanées d’œstradiol, amorcer les animaux avec des granulés de progestérone sous-cutanée deux jours avant la décidualisation artificielle.Avant la chirurgie, anesthésiez la souris et testez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de pincement des orteils. Ensuite, placez la souris en position couchée, soulevez sa queue et insérez lentement un spéculum de six millimètres dans son vagin. Placez le bas du corps de la souris entre les deux premiers doigts de la main non dominante.Ensuite, à l’aide de l’index, poussez doucement la queue vers le haut pour permettre une meilleure accessibilité vaginale. Transférez 20 microlitres d’huile de sésame dans une pointe de transfert d’embryon non chirurgicale et insérez l’embout à travers le vagin et le col de l’utérus dans la corne utérine. Expulsez lentement l’huile.Une fois cela fait, retirez le spéculum du vagin. Dans cette étude, 80% des souris ont subi une décidualisation réussie, tandis que 20% ne l’ont pas fait. Il est donc important de garder tout votre équipement chirurgical et vos zones de travail stériles et d’avoir des patients lors de l’insertion du dispositif AINS à travers le col de l’utérus dans la corne utérine de la souris.Après avoir induit une décidualisation artificielle, le palais de progestérone peut être retiré pour imiter la menstruation et étudier la dégradation de l’endomètre. En utilisant cette méthode, nous pouvons étudier la biologie utérine et la régulation indépendamment de l’influence des ovaires. C’est vraiment passionnant dans le domaine de la fertilité et de la santé des femmes en général.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Évaluation de la maternelle remodelage vasculaire pendant la grossesse dans l&#39;utérus de la souris

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Recherche

Biologie du développement

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Une nouvelle utilisation d’échographie en trois dimensions de haute fréquence pour la caractérisation de grossesse précoce chez la souris

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

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