Name: in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells at JoVE.com

ラルフ・ゴールド教授とジサ・エルリッヒマン博士のアドバイスとサポートに感謝します。

すべての手順は、実験動物の世話と使用に関する欧州共同体理事会指令に従って実施されました。
1. シュワン細胞培養
<ol><li>シュワン細胞培養用コーティング<ol><li>細胞培養皿を無菌条件下でコーティングします。2 mLの0.01%ポリ-L-リジン(PLL)をそれぞれ2つの60 mm組織培養(TC)ディッシュに塗布し、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>PLLを取り出し、TC?...

<ol>
	<li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+cell+body+size,+axon+size,+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat.">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li><li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination.">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li><li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation.">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652 (2020).</li><li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury.">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li><li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+injury+and+myelination:+Potential+therapeutic+strategies.">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li><li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen.">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li><li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells.">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li><li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation.">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li><li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion/Schwann+cell+cocultures.">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination.">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li><li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRG+neuron/Schwann+cells+myelinating+cocultures.">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li><li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation,+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves.">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781 (2016).</li><li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells.">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58 (2019).</li><li>Gr&#252;ter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells.">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145 (2020).</li><li>Lehmann, H. C., H&#246;ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies.">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS &amp; Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li><li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+(CIDP).">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255 (2016).</li><li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis.">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li><li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis.">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293 (2021).</li></ol>

ここでは、2つの別々の細胞型培養物、シュワン細胞と後根神経節外植片をマージすることにより、 in vitro 髄鞘形成を生成するための迅速で簡単なプロトコルを提示します。
プロトコルの重要なステップは、特に培養の最初の数日間のDRG外植片の栽培です。DRGは、強力な軸索ネットワークが構築される前は非常に脆弱であり、インキュベーターから取り出したとき...

末梢神経系(PNS)では、急速な情報伝達はミエリンに包まれた軸索によって媒介されます。神経線維の伝導速度は軸索径とミエリンの厚さに相関するため、軸索の髄鞘形成は電気インパルスの高速伝播を可能にするために不可欠です1。末梢から中枢神経系(CNS)への感覚シグナル伝達は、後根神経節(DRG)と呼ばれる後根の拡大に存在する一次感覚ニューロンの活性化に依存しています。ミエリンの形成と維持のためには、軸索とPNSの有髄グリア細胞であるシュワン細胞との間の継続的なコミュニケーションが必須です2。
PNSの多くの疾患は、原発性軸索または脱髄損傷のいずれかによる情報の伝達を妨げ、知覚異常または感覚異常をもたらす。一次感覚ニューロンは、ニューロン損傷後、ニューロンと周囲のシュワン細胞との複雑な相互作用によってある程度再生する能力を有する3。この場合、シュワン細胞は細胞のリプログラミングを受けて軸索およびミエリンの破片を取り除き、軸索再生を促進し、髄鞘再形成をもたらすことができる4。PNSの脱髄障害の可能な治療選択肢を見つけるために、健康と病気における髄鞘形成のメカニズムを理解することは重要です。ミエリンは急性神経外傷によっても損傷を受ける可能性があり、末梢神経損傷後の機能回復を促進するために髄鞘形成を促進するアプローチが研究中です5。
末梢髄鞘形成に関する私たちの知識は、シュワン細胞と感覚ニューロンの有髄共培養から主に恩恵を受けています。最初のアプローチが適用されて以来6、7、8、髄鞘形成は、異なる共存系の使用により鋭意研究されてきた9、10、11。ここでは、後根神経節軸索の堅牢なin vitro髄鞘形成のための迅速かつ容易なプロトコルを提供します。シュワン細胞調製のためのプロトコルは、以前にPitarokoiliら13で発表されたAndersenらによるプロトコル12に基づいている。共培養には、幼若ラット由来のシュワン細胞と胚性DRG外植片培養物を使用し、14日目頃に髄鞘形成が起こります。この方法の目的は、直接軸索-シュワン細胞相互作用の結果としてのミエリンの形成を調査し、PNS髄鞘形成のモジュレーターを研究するシステムを提供することです。解離した神経細胞培養と比較して、DRG外植片はより解剖学的に保存され、長い軸索突起を形成します。有髄軸索領域の定量化は、共培養における髄鞘形成のための十分な読み出しを提供する。この方法は、PNS髄鞘形成に対する潜在的な効果について治療用化合物をスクリーニングするための貴重なツールであり、動物モデルでのin vivo研究に加えて利用することもできます14。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-MBP, rabbit</td>
			<td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td>
			<td>ABIN446360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#223;III-tubulin, mouse&#160;</td>
			<td>Biolegend, San Diego, USA</td>
			<td>657402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>A4403-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27-supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70760212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 1250 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701186210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 20 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>701114210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosphere Filter Tip, 300 &#181;L</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>70765210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 100 &#181;M</td>
			<td>BD Bioscience, Heidelberg, Germany</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>5811000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Heracell</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 12 mm</td>
			<td>Carl Roth, Karlsruhe, Germany&#160;</td>
			<td>P231.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved fine forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount-G(R)</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>SBA-0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water (Water Purification System)&#160;</td>
			<td>Millipore, Molsheim, France</td>
			<td>ZLXS5010Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>31331093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (no Ca2+ and no Mg2+)</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D8537-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>1009862500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F7524</td>
			<td>FCS must be tested for Schwann cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>F6886-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>G1393-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany</td>
			<td>5710064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (no Ca2+ and no Mg2+)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>14170138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell Incubator</td>
			<td>Heraeus Instruments, Hanau, Germany&#160;</td>
			<td>51017865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraguard ECO 1.2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51029882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Pan-Biotech, Aidenbach, Germany</td>
			<td>P30-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J Software</td>
			<td>HIH, Bethesda, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#180;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multistand&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130042303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Motic, Wetzlar, Germany</td>
			<td>Motic BA 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Axio observer 7</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>491917-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>VWR, Radnor, USA&#160;</td>
			<td>630-1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130091632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer counting chamber&#160;</td>
			<td>Assistant, Erlangen, Germany</td>
			<td>40441 &#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin</td>
			<td>Peprotech, Rocky Hill, USA</td>
			<td>100-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGF</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>N1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Biozol, Eching, Germany</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon &#916; multidishes, 4 well</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics, New Jersey, USA&#160;</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>4430000018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td>
			<td>2231300004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysin</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>P4707-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 15&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62554502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes, 50&#160;mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>62547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction vessels, 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>72690001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Cabinet S2020 1.8</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>51026640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14083-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861254025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861685001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>861253001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>10094-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Discovery.V8</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany&#160;</td>
			<td>495015-0012-000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany</td>
			<td>14007-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833902300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833900300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 60, cell +</td>
			<td>Sarstedt, N&#252;mbrecht, Germany&#160;</td>
			<td>833901300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-094-523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany&#160;</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I Collagenase</td>
			<td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germany&#160;</td>
			<td>C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath type 1008</td>
			<td>GFL, Burgwedel, Germany&#160;</td>
			<td>4285</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro myelination of peripheral axons in a coculture of rat dorsal root ganglion explants and schwann cells

髄鞘形成のプロセスは、神経系における迅速かつ十分なシグナル伝達を可能にするために不可欠です。末梢神経系では、ニューロンとシュワン細胞が複雑な相互作用を起こして軸索の髄鞘形成を制御します。この相互作用の乱れとミエリン鞘の破壊は炎症性神経障害の特徴であり、神経変性疾患で二次的に発生します。.ここでは、末梢神経系における髄鞘形成のプロセスを調査し、軸索-シュワン細胞相互作用を研究し、各細胞タイプに対する治療薬の潜在的な効果を評価するために、末梢軸索の堅牢な髄鞘形成を開発する後根神経節外植片とシュワン細胞の共培養モデルを紹介します。方法論的には、胚性ラット(E13.5)の背根神経節を採取し、それらの周囲組織から解離させ、3日間全外植片として培養した。3週齢の成体ラットからシュワン細胞を単離し、坐骨神経を酵素消化した。得られたシュワン細胞を磁気活性化セルソーティングにより精製し、ニューレグリンおよびフォルスコリン富化条件下で培養した。後根神経節外植片培養の3日後、アスコルビン酸を含む培地中で1つの後根神経節外植片に30,000シュワン細胞を添加した。髄鞘形成の最初の徴候は、共培養の10日目に、免疫細胞化学染色におけるミエリン塩基性タンパク質の散在シグナルを介して検出された。14日目以降、ミエリン鞘が形成され、軸索に沿って伝播した。髄鞘形成は、髄鞘形成面積と軸索面積の比としてミエリン塩基性タンパク質染色によって定量化することができ、軸索密度の違いを説明する。このモデルは、末梢神経系の炎症性および神経変性疾患における脱髄および神経変性の病理および可能な治療機会を理解するために不可欠な、 in vitroでの末梢髄鞘形成のさまざまな側面を研究する実験的機会を提供します。

共培養における髄鞘形成は、10、12、14、16、18、および20日目に評価されました。DRG外植片およびシュワン細胞をMBP、βIII-チューブリン、およびDAPIについて染色した。共存における軸索網は密集しており、観察の経時的には目に見えて変化しなかった。小さな断片の形のミエリンの最初の兆候は、10日目に検出され、12日目に増加しました(図2)。MBP陽性領域は、培養20日目...

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In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

後根神経節とシュワン細胞の共培養系では、末梢神経系の髄鞘形成を研究することができます。このモデルは、末梢髄鞘形成を観察および定量化し、ミエリン鞘に対する目的の化合物の影響を研究するための実験的機会を提供します。

ラット背根神経節外植片とシュワン細胞の共培養における末梢軸索のin vitro髄鞘形成

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

このモデルは、in vitroで末梢神経系の髄鞘形成の様々な側面を研究するための実験的機会を提供する。ミエリンの定量と軸索-シュワン細胞相互作用の検査を可能にします。共培養は、14日目以降に強力な髄鞘形成を発症します。DRG外植片培養は、解離したニューロン培養と比較して、無傷の構造構造の利点を提供します。この方法は、末梢神経系の炎症性疾患および神経変性疾患に対する向性化合物のスクリーニングに利用可能です。まず、安楽死させたラットの胴体の作業領域を70%エタノールで滅菌します。ラットの左背下肢をハサミで開き、上腕二頭筋の大腿骨筋を慎重に取り除きます。湾曲した鉗子で滑らかな隆起によって坐骨神経を緩め、神経を傷つけないようにします。鉗子を使用して、 切り取られた神経を、ゲンタマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む氷冷ライボビッツのL-15培地を含む組織培養皿に移します。次に、実体顕微鏡を使用して、2対の細かい鉗子で神経から脂肪、筋肉、血管を取り除きます。坐骨神経の近位端と遠位端を特定し、近位神経端を2対の細かい鉗子で保持しながら、近位から遠位方向に1対の細かい鉗子で上神経を取り除きます。精製した神経を、ゲンタマイシンを含む氷冷したライボビッツのL-15培地で別の組織培養皿に移した後、単離された神経束をいじめ、2対の細い鉗子を使用して単一の神経線維を分離および分離します。10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して神経線維を50ミリリットルのチューブに移し、できるだけ少ない培地を取ります。次に、ゲンタマイシンを含む50ミリリットルのリーボビッツL15培地を神経線維に数回加えます。神経線維を含むチューブを188Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を除去した後、残りのLeibovitzのL-15培地を含むペレットを60ミリメートルの組織培養皿に移します。50ミリリットルのチューブを10ミリリットルの酵素消化溶液ですすぎ、神経線維皿に加えます。ピペットの先端で皿の中の神経線維を慎重に分配します。摂氏37度と5%二酸化炭素で18時間インキュベートします。そして、HBSSに40%FCSで10ミリリットルを加えて酵素消化を停止します。消化した神経を50ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で10分間188Gで遠心分離します。上清を廃棄した後、10%FCSおよびゲンタマイシン1ミリリットル当たり50マイクログラムを含む10ミリリットルのDMEMにペレットを再懸濁する。次に、細胞懸濁液を100マイクロメートルの細胞ストレーナーでろ過します。摂氏4度で188Gで10分間遠心分離した後、FCSとゲンタマイシンを含む4ミリリットルのDMEMでペレットを再懸濁します。2つのポリリジンおよびラミニンコーティングされた60ミリメートル組織培養皿のそれぞれに2ミリリットルの細胞懸濁液を加える。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートし、プレートをインキュベーター内で2日間そのままにします。このシュワン細胞懸濁液を188Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、細胞ペレットを1回あたり90マイクロリットルの磁気細胞分離バッファーに1回ずつ10〜7番目の細胞に再懸濁した。次に、10番目のセルに10回あたり10マイクロリットルのti1マイクロビーズを追加します。再懸濁した溶液を摂氏8度の暗所で15分間インキュベートします。次に、2ミリリットルの磁気細胞分離バッファーを細胞懸濁液に加える。摂氏4度で300Gで10分間遠心分離した後、ペレットを500マイクロリットルの磁気細胞分離バッファーに再懸濁します。磁気セル分離カラムをセルセパレータに入れ、1ミリリットルの磁気セル分離バッファーでカラムを湿らせます。次に、細胞をそれに適用して、遠心分離のためにフロースルーを収集します。安楽死させた妊娠中のラットから子宮を慎重に取り除き、氷冷HBSSを含む100ミリメートルの組織培養皿に入れます。湾曲した鉗子を使用して子宮を保持し、細かい鉗子で子宮壁を開きます。羊水袋を1つ取り出し、細かい鉗子で穴をつまんで慎重に開きます。子宮からすべての胚をすばやく取り除き、HBSSで満たされた皿に移します。1つの胚の胴体をHBSSで満たされた35ミリメートルの皿にそっと入れます。実体顕微鏡下で、胴体の背側部分を開いて胚を2つに分割します。半分を横に回して、胚の背部の線に位置する後根神経節(DRG)の鎖を特定します。細かい鉗子とマイクロハサミを使用して、DRGをストランド全体として切り取ります。2ミリリットルのHBSSで満たされた新鮮な皿にDRGを入れた後、細かい鉗子とマイクロハサミを使用して、残りの組織から単一のDRGを分離します。各ウェルに190マイクロリットルのDRG増殖培地を含む4ウェルプレートを取り、細かい鉗子とヘラを使用して単一のDRGを各ウェルの中央に慎重に移します。次に、DRG外植片培養物を摂氏37度と5%二酸化炭素のインキュベーターに入れます。翌日、50マイクロリットルのDRG増殖培地を各ウェルに注意深く添加し、顕微鏡を使用してDRG外植片の付着と軸索の成長を毎日観察します。DRG外植片培養の3日目に共培養するには、DRG増殖培地を、ウェルあたり30, 000シュワン細胞を含む250マイクロリットルの共培養培地と慎重に交換します。免疫細胞化学染色を行うには、DPBS洗浄した細胞を4%パラホルムアルデヒド中で10分間インキュベートすることにより、カバースリップ上に細胞を固定します。倒立顕微鏡を使用して、中央のDRG外植片を囲む8つの定義された領域で免疫細胞化学的に染色されたサンプルの写真を撮ります。ここでは、細長い紡錘形の形態を持つシュワン細胞と、共培養における薄いDRG軸索の出現を示しています。共培養における髄鞘形成は、ミエリン塩基性タンパク質またはMBP、β3チューブリン、およびDAPIについてDRG外植片およびシュワン細胞を染色することによって異なる日に評価した。共培養における軸索網は密集しており、観察の経時変化において目に見えて変化しなかった。髄鞘形成の最初の兆候は、共培養の10日目と12日目に見られました。14日目からMVPシグナルがより顕著になり、ミエリン包内軸索が検出された。髄鞘形成は20日目までの共培養時間とともに増加した。髄鞘形成は、MVPとβ3つのチューブリン陽性領域の比率として定量した。髄鞘形成の有意な増加は、10日目と比較して18日目および20日目に観察された。DRG外植片培養は壊れやすいため、慎重に取り扱う必要があります。例えば、インキュベーターから取り出したとき、または培地交換および固定中である。共培養サンプルの遺伝子発現解析は、ミエリンをより詳細に調査するために形成することができる。ここでは、22日目にミエリンマーカーPMP22、MAG、Oct6、Egr2、Olig1を検出しました。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

神経科学

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

後根神経節ニューロンのアライメントや髄鞘形成を強化するためのアプローチ

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

後根神経節インジェクションおよび後根感覚軸索再生のためのモデルとして傷害をつぶします

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine

腰部後根神経節のアクセスと豚注入の椎

Dorsal root ganglia (DRG) are anatomically well defined structures that contain all primary sensory neurons below the head. This fact makes DRG attractive ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

成体マウス後根神経節の調査の哺乳類の軸索の再生: In Vivoエレクトロポレーション

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...