Name: cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory at JoVE.com

这项工作之所以成为可能，要归功于霍华德休斯医学研究所（HHMI）的资助。我们要感谢我们的实验室负责人 Jue Chen 阅读手稿并感谢她的持续支持，感谢 Donna Tallent 的有益编辑和评论，感谢洛克菲勒大学信息技术系的 Jeff Hennefeld 对本手稿视频部分的帮助。

1. 准备工作 
<ol><li>常规<ol><li>穿着干净的实验室外套，指定仅在细胞培养室穿着，不得在实验室的其他部分穿着。 注意：实验室外套不需要无菌。</li>
		<li>戴上未接触任何其他表面的新手套。确保手套紧贴。丁腈、无粉手套是最好的。 注意：手套不需要无菌。</li>
		<li>为了准备工作，用70%的EtOH喷洒手套，实验室衣套和生物安全柜的内部。用不起毛的纸巾擦干工作表面和玻璃面...

<ol>
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虽然污染是进行细胞培养工作时的主要问题之一，但本手稿中概述的实践和技术将有助于降低风险。关键步骤包括穿着干净的实验室外套，仅在细胞培养室使用，使用干净的无粉手套，这些手套经常喷洒70%EtOH，并在细胞系之间切换时更换，鼓励每个人不要共用培养基瓶，在完成工作之前和之后彻底清洁机柜， 整齐地打开血清移液器，避免长时间密切接触打开的瓶子或烧瓶，不要在多个细胞系之?...

细胞培养在研究实验室中有许多用途。自20世纪初细胞培养起源以来，细胞系一直帮助推动科学发展。细胞系有几个优点;各种细胞系可以帮助研究人员研究细胞生物学，产生杆状病毒用于进一步研究，或产生大量感兴趣的蛋白质，仅举几例1。一些额外的用途包括研究组织生长，帮助推进疫苗开发，毒理学研究，研究基因在健康生物体和患病模型中的作用，以及杂交细胞系的生产2，3。细胞系还可以实现药物生产3。使用细胞系时，需要适当的无菌技术;本手稿中概述的实践和技术适用于进行细胞培养工作的研究实验室。其他实验室设置不讨论。
在进行细胞培养工作时，污染通常是主要关注的问题。在本文中，污染通常是指真菌和细菌。本文概述的方法的总体目标是全面描述避免污染的最佳实践。所有实验室成员在研究实验室的细胞培养室工作时都应遵守这些做法。实验室应确保所有工人积极参与使用这些最佳实践来防止污染。正确的实践和技术知识将有助于确保细胞培养物保持活力、健康和不受污染。该技术的发展基于文献研究、七年的细胞培养经验，以及对新手和经验丰富的细胞培养工作者每年都可以参考的方法的需求。
需要一种清晰、标准化的技术，所有研究细胞培养实验室都应遵循。许多关于细胞培养污染的文献讨论了支原体的检测、无菌技术、污染源、污染物的消除以及通过使用抗生素和定期检测进行预防4，5，6，7，8。虽然这些信息很有帮助，但文献中没有视频来展示应该遵循的正确细胞培养技术。与其他技术相比，所介绍的做法的优势在于专注于在污染发生之前防止污染，而不是在以后发现和纠正错误。此外，无菌技术的全面演示、关于防止真菌和细菌生长的讨论以及有关生物安全柜气流的信息对于新手和有经验的细胞培养工作者都很有价值。
细菌和真菌是两种最常见的污染物类型。在细菌类别中，支原体是一个主要问题，因为它体积小，能够增殖而不被注意。它们是自我复制的生物，没有依靠真核细胞生长的刚性细胞壁。尽管透射电子显微镜可以检测到支原体9，10，但它们的代谢能力降低，并且可以大量繁殖，同时在细胞培养物的常规目视检查和定期显微镜分析中仍未被识别。此外，它们可以通过微生物过滤器10。细胞培养基为支原体提供营养，但不幸的是，用抗生素补充培养基不会影响支原体10。应该注意的是，一般来说，没有必要用抗生素补充培养基;适当的技术应该足以防止污染。支原体感染不会导致细胞立即死亡，但研究人员担心它会影响数据的可重复性和质量。
所有实验室人员应严格遵守良好的细胞培养规范。培养物应在新购买后、当前生长期间、冷冻保存前以及从液氮2，10 解冻时检测支原体。市场上有不同的测试，使用聚合酶链反应（PCR），酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫染色。3 文献表明，“人分离株占细胞培养中发现的支原体污染物的很大一部分”5。尽管已经描述了200多种支原体，但其中约6种占大多数感染。这六个物种是 M. arginini、M. fermentans、M. hominis、M. hyorhinis、M. oral 和 Acholeplasma laidlawii10。与其他类型的污染一样，空气和气溶胶将这些污染物带入细胞培养物5。这在其他论文中得到了回应，因为“人类操作员可能是实验室中最大的危险”7。虽然这是通过人为错误完成的，但如果遵循标准程序，则可以消除风险。人员脱落不仅限于支原体污染;一个实验室中的细胞培养物通常感染相同的支原体物种，这表明由于不正确的细胞培养技术，污染从一个烧瓶扩散到另一个烧瓶10。
防止交叉污染也是应遵循适当的细胞培养技术的另一个原因。值得注意的是，全球至少有15%-18%的细胞系可能被交叉污染或错误识别11，12。除了测试细胞系的支原体污染外，还应测试它们的交叉污染10。对于人类细胞系，通过一种称为短串联重复（STR）分析的廉价基于DNA的技术进行细胞系鉴定是当前的国际参考标准，因为它是确认细胞系身份的简单方法2，10，13，14。STR可以识别错误标记或交叉污染的细胞系，但不能检测不正确的组织来源10，13，14。如果细胞系被错误标记、错误识别或污染，研究数据的有效性可能会受到损害13.与其他类型的污染类似，由于技术不佳导致气溶胶扩散，错误接触导致错误的细胞类型进入烧瓶，或使用相同的培养基瓶和具有不同细胞系的试剂，可能会发生交叉污染10。不应共享媒体瓶;在两个不同的细胞系之间共享一瓶培养基可以使这些细胞群混合，导致生长更快的细胞类型完全接管烧瓶。这种替换并不明显，会导致标签错误和错误识别2.如果在处理或标记过程中培养物混淆，则也可能将细胞系误认为另一种细胞系10。应特别注意将试剂、培养基和培养瓶彼此分开。每个实验室成员都应该有自己的培养基瓶;实验室成员之间不应进行共享。细胞系本身应从合格的细胞库和供应商处购买。实验室不应共用细胞。研究表明，尽管经常使用STR和支原体检测，但文献中的许多研究论文已经使用了错误识别或污染的细胞系15。筛选研究以找到这些有问题的论文并追溯告知读者此事是很麻烦的。预防是确保此问题不会首先发生的最佳方法。
喷洒含有70%EtOH的物品的简单动作即可杀死生物体;70%的EtOH通过使蛋白质变性和溶解最常见的污染生物（包括细菌和真菌）中的脂质起作用16。研究表明，70%是最有效的浓度;表面蛋白不会与70%的EtOH快速凝结，因此它们可以进入细胞，而它所含的水是蛋白质变性过程所必需的。由于细胞壁两侧的水和酒精的浓度差异，70%的EtOH进入细胞使酶和结构蛋白变性。如果在烧瓶中观察到霉菌生长，则必须首先用70%EtOH喷洒并擦干整个培养箱，然后在60°C下孵育16小时过夜17。这可以杀死大多数霉菌和任何细菌。
与在污染发生后消除污染的替代技术相比，预防措施的主要优势在于，通过及早预防污染，实验室工作人员可以确保他们的细胞培养物是健康的，并且不会有与培养箱净化或丢弃细胞培养物相关的高成本。例如，消除支原体污染物后效率不高7.尽早花时间确保实验室人员接受适当的培训，细胞培养室是独立的，并使用标准程序将节省时间和金钱。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F-12 Media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Baffled Flask</td>
			<td>Pyrex&#160;</td>
			<td>09-552-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>13-681-15A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipette</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-200-573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>07-202-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Items may vary because this video is about general cell culture techniques</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell culture techniques and practices to avoid contamination by fungi and bacteria in the research cell culture laboratory

细胞培养是在受控环境中生长人类、动物和昆虫细胞或其他组织所必需的一项精细技能。该协议的目标是强调研究实验室中使用的正确技术，以防止真菌和细菌污染。特别强调避免支原体污染，这是细胞培养室的一个主要问题，因为它体积小，对用于细胞培养的大多数抗生素具有抗性。这些相同的技术可确保持续生长并保持健康的细胞。对于新的和有经验的细胞培养用户，始终如一地遵守这些最佳实践以降低污染风险非常重要。实验室应每年审查一次细胞培养最佳实践，并在需要时进行讨论或额外培训。与污染发生后进行清理相比，尽早采取行动防止污染将节省时间和金钱。通用的最佳实践可保持细胞培养的健康，从而减少不断解冻新细胞的需要，购买昂贵的细胞培养基，并减少培养箱净化和停机时间。

如果不遵循本文中概述的正确细胞培养技术和实践，研究细胞培养实验室可能会受到真菌和细菌的污染。 图2 显示了悬浮液和贴壁培养物中含有污染物的培养瓶。
如果不遵循无菌技术，2-3天后可能会发生霉菌污染。悬浮细胞中漂浮在培养基中的圆形绒毛球很明显，而附着细胞中的霉菌生长可以观察到大块、不规则、白色或绿色斑块。
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Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

该协议介绍了研究细胞培养实验室中使用的基本细胞培养技术和实践，以避免真菌和细菌污染。在细菌类别中，将特别强调防止支原体污染。

在研究细胞培养实验室中避免真菌和细菌污染的细胞培养技术和实践

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

细胞培养是在受控实验室环境中培养各种类型的细胞和组织所必需的精细技能。进行细胞培养工作时的主要问题是污染。这种污染可能以细菌、霉菌或支原体的形式出现。本视频中概述的所有技术和实践将确保您的细胞保持活力、健康和无污染。应严格遵守这些做法，所有实验室人员应每年至少接受一次培训。在开始工作之前，请穿上仅在细胞培养室使用的干净实验室外套。戴上未接触任何其他表面的新手套。确保手套紧贴。丁腈无粉手套是最好的。实验室外套和手套不需要无菌。为了准备工作，用70%乙醇喷洒手套，实验室衣套和生物安全柜的内部。从内部和外部喷洒工作表面、侧面、背面、机柜中的任何物品和前玻璃面板。用不起毛的纸巾擦干工作表面和玻璃面板。花一些时间安排机柜内的工作空间。将水浴放在细胞培养室内，并仅将其用于细胞培养目的，例如加热培养基或解冻细胞。水浴应每周排干和清洗一次。限制带入机柜的物品数量，不要通过阻塞前格栅或后格栅来中断生物安全柜内的气流。用70%乙醇喷洒橱柜内的所有物品并擦干。首先喷洒培养基瓶的顶部，然后向下喷洒。用干净的纸巾，从培养基瓶的顶部开始擦干，逐渐向下。不要朝盖子走回去。这些机柜的工作方式是它们通过前后格栅从房间和机柜本身抽取空气。空气流向机柜的背面并到达顶部。在那里，受污染的空气通过成堆的过滤器，部分过滤后的清洁空气被推到机柜的工作区域。如果柜子足够大，可以容纳血清移液器，则可以将它们放在里面，否则，它们可以存放在安装在柜子外部的容器中。使用前最好检查包装中的移液器两侧是否有孔洞、撕裂或穿孔。不要撕掉包装。相反，轻轻剥开包装的末端。将血清移液器插入移液器辅助设备，并以一个流体动作取下包装。不要将鼠标悬停在任何打开的瓶子或烧瓶上。不建议将手伸过打开的瓶子或烧瓶，或在打开的烧瓶上方工作。机柜内的气流压在里面的任何东西上。伸手过去可以让您的袖子或手套放在物品上，这可能会将袖子上存在的任何污染物推到细胞培养物中。尽可能不要倒入液体。相反，使用血清移液器添加它们。彻底混合内容物并初始化瓶子。写下媒体的补充内容。如果您正在使用贴壁培养物并且需要一个塑料烧瓶，请喷洒整个包装并将其放入内部。每当你的手套干涸时，再次用乙醇喷洒它们。使用贴壁细胞系时，使用高压灭菌玻璃移液器或一次性无菌塑料移液器吸出培养基或洗涤溶液。小心地从存储容器中取下金属盖。通过以一定角度轻轻摇晃容器来隔离一个玻璃移液器。将手伸入容器时，避免触摸任何其他移液器。仅从一端处理所选移液器。尽快快速更换瓶子和烧瓶上的盖子。将盖子倒置放在工作台面上，使轮辋不会接触工作台面。不要从顶部或底部抓住盖子。相反，请从侧面触摸盖子。吸入液体时，请使用位于机柜外的真空捕集瓶，放在地板上的辅助容器中。在机柜内工作时会产生废物。由于经常将手移入和移出机柜会中断气流，因此可以暂时将任何废物留在机柜内。将其放在一边，这样它就不会中断您的工作。每当手套变干时，请大量喷洒70%乙醇。揉搓双手，以免它们滴湿。关于血清移液器的快速说明。如果他们不小心碰到了引擎盖中的其他东西，请不要犹豫，把它们扔掉。最好从干净的血清移液管重新开始，而不是使用可能被污染的移液器。在将细胞放入培养箱之前，请检查它们在显微镜下的外观。应观察单细胞。这表明细胞已被彻底重悬。不要说话、打喷嚏、咳嗽或对着培养箱重呼吸。快速打开和关闭培养箱门。让它们打开的时间超过必要的时间可能会使空气中存在的污染物进入培养箱。确保所有瓶子上的盖子都完全关闭，然后再将它们从柜子中取出。介质对光敏感。不使用时应存放在四摄氏度的黑暗中。细胞培养工作完成后，再次用70%乙醇喷洒柜子内部，并用纸巾擦干表面。清空生物危害废物袋。重复此过程，并在切换到其他细胞系时更换手套。使用在玻璃烧瓶中生长的悬浮培养物时，请确保手套是湿的。用湿手套触摸铝箔，然后只喷洒烧瓶的底部，然后再将其放入生物安全柜。取样进行细胞计数时，仅从容器中取出一个 1.5 ml 管。请勿触摸任何其他管子。将盖子倒置放在工作表面上。请勿触摸内缘。从侧面小心处理它，完成后更换它。处理悬浮细胞和玻璃烧瓶时，请小心地取下覆盖烧瓶整个颈部的双折叠铝箔。轻轻拉动所有四个角，然后将箔纸倒置放在工作表面上。仅从底部处理玻璃烧瓶。箔片脱落后，请勿从脖子上触摸它。使用1ml血清移液管取样进行细胞计数。不要让培养基从烧瓶侧面滴落。如果是这样，请用70%乙醇喷洒纸巾并立即清理。在从生物安全柜中取出瓶子或烧瓶之前，确保盖子或铝箔已拧紧。对不同的细胞类型使用单独的培养箱。这将防止不同细胞类型的交叉污染。建议将用于收集液体废物的真空捕集瓶放置在地板上的柜外的次要容器中，标记为废物。软管连接到每月更换一次的过滤器。软管从机柜侧面进入。工作完成后，清除生物危害垃圾。在水槽旁的墙上保留玻璃清洗方案。首先，用10%漂白剂浸泡丢弃的细胞约五分钟。然后丢弃漂白剂混合物并用水彻底冲洗烧瓶。用水加入肥皂，用刷子擦洗干净，用更多的水冲洗。然后最后一步是用右侧水龙头上的去离子水冲洗玻璃器皿。尽快清洗玻璃烧瓶，将玻璃器皿擦洗干净。如果Sf9细胞没有正确擦洗，它会离开这个死细胞边缘。这些烧瓶仅用于细胞培养，高压灭菌细胞培养玻璃器皿，而不是将其送到玻璃洗涤设施。在高压釜上使用真空循环40分钟灭菌时间和40分钟干燥时间。将其与实验室主要区域的玻璃器皿分开。组织细胞培养室，使所有耗材都位于一个区域，从而最大限度地减少实验室成员离开细胞培养室寻找耗材的需要。标记任何用于收获细胞并在之后在细胞培养中重复使用的塑料瓶，仅供细胞培养使用。将指定的细胞培养瓶用于一种特定的细胞类型。将这些瓶子存放在细胞培养室中，以便于取用。对于悬浮生长的培养物，霉菌将在培养基中被识别为漂浮的球。至于细菌污染，它会使介质变白和浑浊。同样，对于贴壁细胞，霉菌污染可以很容易地识别为模糊斑块。细菌污染会变成正常透明的介质，白色和浑浊。许多种类的支原体可以通过基于PCR的测定法可靠地鉴定。左边的条带显示了DNA的分子量标准品。右边的四个波段是阳性对照。在测试细胞类型下没有出现条带，因为未检测到支原体。如果存在pH指示剂，细胞培养基的颜色将从红色变为黄色。黄色表示pH值低，应更换培养基。如果在进行细胞计数时在光学显微镜下观察到其他生长或细胞形状，那么这可能是污染的指标。请注意，在细胞计数之前应彻底清洁血细胞计数器，因为这种类型的碎片可能仅存在于血细胞计数器上，而不存在于细胞培养物本身中。虽然污染是进行细胞培养工作时的主要问题之一，但通过遵循本视频中概述的实践和技术可以减轻这些风险。如果每月进行每月一次支原体检测，实验室人员每年接受培训并严格遵守这些做法，那么您的细胞将保持健康且无污染。这也将有助于降低与购买昂贵的细胞培养基、购买新细胞相关的成本，并将减少培养箱去污停机时间。请记住，成功细胞培养的关键是及早采取行动，以便首先防止污染。

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA结合蛋白的检测通过<em&gt;体外</em在脂肪细胞培养&gt; RNA下拉

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...