Name: ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures
Uploaded: 2023-02-10T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Akış sitometrisine erişim için WIMM Akış Sitometri Çekirdeğine ve lentiviral vektör üretimi için WIMM Virüs Tarama Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma Kay Kendall Lösemi Fonu ve İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

Damızlık ve ötenazi de dahil olmak üzere tüm hayvan prosedürleri, kurumsal ve ulusal yönergeler dahilinde gerçekleştirilmelidir. Aşağıda detaylandırılan deneyler İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerin, reaktiflerin ve ekipmanların bir listesi için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Stok çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>PVA stok çözümü<ol><li>Küçük bir cam şişede 5...

<ol>
	<li>Laurenti, E., G&#246;ttgens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+haematopoietic+stem+cells+to+complex+differentiation+landscapes.">From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes.</a> Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).</li><li>Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+concepts,+definitions,+and+the+new+reality.">Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality.</a> Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).</li><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo.">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).</li><li>Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+haematopoietic+stem+cell+niches.">Adult haematopoietic stem cell niches.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273 (5272), 242-245 (1996).</li><li>Granot, N., Storb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+hematopoietic+cell+transplantation:+challenges+and+progress.">History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress.</a> Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+hematopoietic+stem+cells+in+vitro.">Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 64, 1-5 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+haematopoietic-stem-cell+expansion+allows+nonconditioned+transplantation.">Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation.</a> Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+polyvinyl+alcohol+for+chimeric+antigen+receptor+T-cell+expansion.">Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion.</a> Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).</li><li>Becker, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+cell+cloning+platform+for+gene+edited+functional+murine+hematopoietic+stem+cells.">A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Kobayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+optimization+enables+maintenance+of+quiescent+hematopoietic+stem+cells+ex+vivo.">Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo.</a> Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).</li><li>Kobayashi, H., Takubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+culture+method+to+maintain+quiescent+human+hematopoietic+stem+cells.">A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61938 (2021).</li><li>Aal Wilson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair.">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li><li>Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-conditioned+bone+marrow+chimeric+mouse+generation+using+culture-based+enrichment+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 3568 (2021).</li><li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice.">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 686 (2021).</li><li>Haney, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+CRISPR+screens+identify+SAGA+complex+members+as+a+key+regulators+of+HSC+lineage+commitment+and+aging.">Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Che, J. L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+in+vitro+expanded+hematopoietic+stem+cells.">Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells.</a> EMBO Reports. 23 (10), e55502 (2022).</li><li>Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+potential+of+murine+hematopoietic+stem+cells:+a+rare+property+only+partially+predicted+by+phenotype.">Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+guide+RNA+design+guidelines+for+efficient+genome+editing.">CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing.</a> Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).</li><li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments.">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).</li><li>Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+ex+vivo+expansion+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells.</a> Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).</li><li>Ieyasu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+all-recombinant+protein-based+culture+system+specifically+identifies+hematopoietic+stem+cell+maintenance+factors.">An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).</li></ol>

Bu protokolün HSC biyolojisini, hematopoezi ve hematolojiyi daha genel olarak araştırmak için yararlı bir yaklaşım sunduğunu umuyoruz. FACS saflaştırılmış HSC'ler8 için PVA tabanlı kültür yönteminin ilk geliştirilmesinden bu yana, yöntem genişletilmiştir. Örneğin, yöntemin kemik iliği ile zenginleştirilmiş c-Kit ve negatif yüzey yüklü plakalarla çalıştığı gösterilmiştir14. Transdüksiyon ve elektroporasyon ile uyumluluğu da gösterilm...

Hematopoetik sistem, memelilerde, oksijen tedarikinden patojenlerle savaşmaya, özel kan ve bağışıklık hücresi tiplerine kadar bir dizi temel süreci destekler. Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) tarafından sürdürülen kan sistemi homeostazını desteklemek için sürekli kan üretimi (hematopoez) gereklidir1. En ilkel hematopoetik hücre, kendini yenileme ve çok soylu farklılaşma için benzersiz kapasitelere sahip olan hematopoetik kök hücredir (HSC) 2,3. Bu, esas olarak yetişkin kemik iliği4'te bulunan nadir bir hücre popülasyonudur ve burada yaklaşık her 30.000 hücrede sadece bir sıklıkta meydana gelir. HSC'lerin yaşam boyu hematopoezi desteklediği ve hematolojik stres sonrası hematopoezin yeniden kurulmasına yardımcı olduğu düşünülmektedir. Bu kapasiteler aynı zamanda HSC'lerin ışınlanmış bir alıcıya transplantasyonu takiben tüm hematopoetik sistemi stabil bir şekilde yeniden oluşturmasına izin verir5. Bu, bir HSC'nin fonksiyonel tanımını temsil eder ve aynı zamanda bir dizi kan ve bağışıklık hastalığı için iyileştirici bir tedavi olan HSC transplantasyon tedavisinin bilimsel temelini oluşturur6. Bu nedenlerden dolayı, HSC'ler deneysel hematolojinin ana odak noktasıdır.
Geniş bir araştırma odağına rağmen, HSC'leri ex vivo7'yi istikrarlı bir şekilde genişletmek zor olmaya devam etmiştir. Kısa bir süre önce fare HSC'leri8 için ilk uzun vadeli ex vivo genişletme kültürü sistemini geliştirdik. Bu yaklaşım, nakledilebilir HSC'leri 4 haftalık bir kültür boyunca 234-899 kat genişletebilir. Alternatif yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, protokoldeki en büyük değişiklik, serum albümininin çıkarılması ve sentetik bir polimerle değiştirilmesiydi. Polivinil alkol (PVA), fare HSC kültürleri8 için optimal bir polimer olarak tanımlanmıştır ve şimdi diğer hematopoetik hücre tipleri9'u kültürlemek için de kullanılmıştır. Bununla birlikte, Soluplus (bir polivinil kaprolaktam-asetat-polietilen glikol greft kopolimeri) adı verilen başka bir polimer de yakın zamanda tanımlanmıştır ve bu da klonal HSC genişlemesini iyileştirdiği görülmektedir10. Polimerlerin kullanımından önce, fetal sığır serumu, sığır serum albümin fraksiyonu V veya rekombinant serum albümini şeklinde serum albümini kullanıldı, ancak bunlar HSC genişlemesi için sınırlı desteğe sahipti ve sadece kısa süreli (~ 1 hafta) ex vivo kültürü destekledi7. Bununla birlikte, HSC'leri sessiz bir durumda tutan HSC kültür protokollerinin daha uzun bir ex vivo kültür süresini destekleyebileceği unutulmamalıdır11,12.
Diğer kültür yöntemleriyle karşılaştırıldığında, PVA tabanlı kültürlerin önemli bir avantajı, üretilebilecek hücre sayısı ve protokolün HSC'leri ex vivo izlemek için kullanılabileceği sürenin uzunluğudur. Bu, deneysel hematoloji alanında, fare başına izolalanabilir düşük HSC sayısı (sadece birkaç bin) ve HSC'leri in vivo olarak zaman içinde izlemenin zorluğu gibi çeşitli engellerin üstesinden gelir. Bununla birlikte, bu kültürlerin HSC proliferasyonunu uyardığını, in vivo HSC havuzunun ise ağırlıklı olarak kararlı bir durumda sessiz olduğunu hatırlamak önemlidir13. Ek olarak, kültürler HSC'ler için seçici olmasına rağmen, ek hücre tipleri zamanla kültürlerle birlikte birikir ve nakledilebilir HSC'ler 1 ay sonra 34 hücreden sadece birini temsil eder. Miyeloid hematopoetik progenitör hücreler bu HSC kültürlerinde başlıca kontamine edici hücre tipi gibi görünmektedir8. Bununla birlikte, bu kültürleri heterojen hücre popülasyonlarından HSC'leri zenginleştirmek için kullanabiliriz (örneğin, c-Kit + kemik iliği HSPC'leri14). Ayrıca genetik manipülasyon14,15,16 için HSC'lerin transdüksiyonunu veya elektroporasyonunu destekler. Heterojen kültürlü HSPC popülasyonundan HSC'lerin tanımlanmasına yardımcı olmak için, CD201 (EPCR) yakın zamanda CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Soy fraksiyonu ile sınırlı nakledilebilir HSC'ler ile yararlı bir ex vivo HSC belirteci 10,17,18 olarak tanımlanmıştır.
Bu protokol, PVA tabanlı fare HSC genişleme kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve değerlendirmek için kullanılan yöntemleri ve ayrıca elektroporasyon veya lentiviral vektör transdüksiyonu kullanarak bu kültürlerde genetik manipülasyon protokollerini açıklar. Bu yöntemlerin bir dizi deneysel hematolog için yararlı olması beklenmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12764416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Appleton Woods Ltd</td>
			<td>HC002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle and mortar</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies Limited</td>
			<td>X18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>720-2519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 G needle</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>613-5394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech wipes</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>115-2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS MACS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 &#956;g</td>
			<td>IDT&#160;</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse stem cell factor&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal free recombinant mouse thrombopoietin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-315-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-1171-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127&#160;APC/Cy7 (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD201&#160;APC (clone: eBio1560)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17-2012-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4&#160;APC/Cy7 (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R&#160;APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD8a&#160;APC/Cy7 (clone: 53-6.7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C&#160;APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119&#160;APC/Cy7 (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 24-well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3337</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellBIND plates, 96-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3330</td>
			<td>negative surface charged</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego, Sigma Aldrich, IDT</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Merck Life Science UK Limited</td>
			<td>F7524-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin Coated plates, 96-well</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500.056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61196.AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Enzo Life Sciences (UK) Ltd</td>
			<td>EXB-0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin APC/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T&#252;rks&#8217; solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>109277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virkon</td>
			<td>Mettler-Toledo Ltd</td>
			<td>95015662</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo expansion and genetic manipulation of mouse hematopoietic stem cells in polyvinyl alcohol-based cultures

Kendini yenileyen multipotent hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), yaşam boyu hematopoezi destekleme ve nakil sonrası tüm kan sistemini yeniden oluşturma yetenekleri nedeniyle önemli bir hücre tipidir. HSC'ler, bir dizi kan hastalığı için küratif tedaviyi temsil eden kök hücre nakli tedavilerinde klinik olarak kullanılmaktadır. Hem HSC aktivitesini ve hematopoezi düzenleyen mekanizmaların anlaşılmasına hem de yeni HSC tabanlı tedavilerin geliştirilmesine büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, HSC'lerin ex vivo stabil kültürü ve genişlemesi, bu kök hücrelerin izlenebilir bir ex vivo sistemde incelenmesinde büyük bir engel olmuştur. Yakın zamanda, nakledilebilir fare HSC'lerinin uzun vadeli ve büyük ölçekli genişlemesini ve bunları genetik olarak düzenleme yöntemlerini destekleyebilecek bir polivinil alkol bazlı kültür sistemi geliştirdik. Bu protokol, elektroporasyon ve lentiviral transdüksiyon yoluyla fare HSC'lerini kültüre alma ve genetik olarak manipüle etme yöntemlerini açıklar. Bu protokolün HSC biyolojisi ve hematopoez ile ilgilenen çok çeşitli deneysel hematologlar için yararlı olması beklenmektedir.

HSC'lerin FACS saflaştırılması için, c-Kit ile zenginleştirilmiş kemik iliği içinde, hücrelerin ~% 0.2'sinin genç (8-12 haftalık) C57BL / 6 fareler için CD150 + CD34-c-Kit + Sca1 + Soy popülasyonu olmasını bekliyoruz (Şekil 1). Bununla birlikte, transgenik farelerin veya farklı yaşlardaki farelerin farklı HSC frekansları göstermesi muhtemeldir. 4 haftalık kültürden sonra, CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1<s...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures at JoVE.com

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Burada, ex vivo polivinil alkol bazlı genişleme kullanarak fare hematopoetik kök hücre kültürlerini başlatmak, sürdürmek ve analiz etmek için bir protokol ve ayrıca lentiviral transdüksiyon ve elektroporasyon yoluyla genetik olarak manipüle etme yöntemleri sunulmaktadır.

Ex Vivo Polivinil Alkol Bazlı Kültürlerde Fare Hematopoetik Kök Hücrelerinin Genleşmesi ve Genetik Manipülasyonu

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Bu protokol, fonksiyonel fare hematopoetik kök hücrelerinin genişlemesine ve genetik manipülasyonuna izin vererek, hematopoetik kök hücre biyolojisi ve hematopoezin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu tekniğin avantajı, uzun süreli ex vivo kültürde hematopoetik kök hücreleri destekleyebilmesi ve hematopoez genetiğini sorgulamak için genetik manipülasyona izin vermesidir. Bu kültür sistemi, genetik, moleküler ve biyokimyasal çalışmalar da dahil olmak üzere hematopoetik kök hücre biyolojisi ve hematopoez ile ilgili çeşitli çalışmalar için bir platform teknolojisi sağlar.Sorun giderme tablosu, bu teknikle karşılaşılan yaygın mücadelelerin nedenlerini ve çözümlerini listeler. Kemik iliği hücrelerinin nasıl doğru bir şekilde çıkarılacağını ve okumak yerine tam medya değişikliklerinin nasıl yapılacağını göstermek çok daha kolay ve etkilidir. Hematopoetik kök hücre veya HSC, ekstraksiyona başlamak için, uygun şekilde ötenazi yapılmış farelerden taze izole edilmiş kemikleri temizlemek için tüy bırakmayan hassas görev mendilleri kullanın.Kasları ve omuriliği, yaklaşık üç mililitre PBS içeren bir harç içine eklemeden önce kemiklerden çıkarın. Bir havane kullanarak, kesme kuvvetlerini en aza indirmek için kemikleri öğütmeden ezin. Daha sonra, 5 mililitrelik bir şırıngaya tutturulmuş 19 kalibrelik bir iğne kullanarak, PBS'ye salınan büyük kemik iliği parçalarını parçalayın ve süspansiyonu 70 mikronluk bir filtreden 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Süspansiyon aktarıldıktan sonra, kemikler ağartılana kadar işlemi taze PBS ile tekrarlayın. Fare başına yaklaşık 30 mililitre ve iki fare için 50 mililitrelik bir uç hacmi hedefleyin, daha fazla ilik görünmeyene kadar kemikleri ağartın. Üstünde 50 mikron filtre ve altında 15 mililitrelik konik tüp bulunan manyetik kolon ayırıcının mıknatısına manyetik bir filtrasyon kolonu yerleştirerek kolon zenginleştirmeye hazırlanın.Daha sonra, hücreleri allophycocyanin anti-c-Kit antikoru ve allophycocyanin manyetik mikroboncukları ile tedavi ettikten sonra, 50 mikron filtre ve filtrasyon sütunundan üç mililitre steril PBS çalıştırın. PBS geçtikten sonra, hücre süspansiyonunu sütundan geçirin, ardından her seferinde üç mililitre soğuk PBS'nin üç yıkamasını yapın. Her yıkamadan sonra, bir sonraki yıkama için PBS eklemeden önce sütunun damlamasının durmasını bekleyin.Daha sonra, sütunu mıknatıstan çıkarın ve taze bir 15 mililitrelik tüpün üzerine yerleştirin ve kolon pistonunu üzerine takmadan ve pistonu iterek hücreleri sökmeden önce kolona beş mililitre soğuk PBS ekleyin. Mililitre başına 0,5 ila 1 milyon hücreyi tohumlamak için istenen sayıda hücre veya kuyucuk için yeterli HSC ortamı hazırlamak üzere metinde açıklanan protokolü izleyin. Daha sonra c-Kit ile zenginleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri veya HSPC'leri döndürün ve peleti taze hazırlanmış HSC ortamında istenen hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın.Hücreleri fibronektin kaplı veya negatif yüzey yüklü plakalara aktararak uygun hacmi koruyun. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücre kültürlerini rahatsız etmeden plakayı doku kültürü inkübatöründen nazikçe çıkardıktan sonra, ortamın yaklaşık% 90 ila% 95'ini her bir kuyucuğun sıvı menisküsünden yavaşça aspire etmek için bir pipet veya vakum pompası kullanın.Kuyunun tabanından ortam çekmekten kaçının. Ardından, kuyuya 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış bir mililitre taze ortam ekleyin. Plakayı doku kültürü inkübatörüne geri gönderin ve deney gerektirene kadar her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin.Hücreleri nükleofeksiyon tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, hücre süspansiyonunu derhal kompleks ribonükleoproteini içeren PCR tüpüne aktarın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Şimdi karışımı uygun hacimde bir elektroporasyon küvetine çok yavaş bir şekilde aktarın ve küvetin içinde hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için sürekli bir sıvı hareketini koruyun. Ardından, elektroporatörde, elektroporasyona tabi tutulan kuyucukların konumunu seçin.Dokunmatik ekranı kullanarak, hücre tipi programını CD34-pozitif insan olarak seçin veya EO100 darbe kodunu yazın ve ardından OK düğmesine basın. Küveti elektroporatöre aktarın ve elektroporasyonu başlatmak için dokunmatik ekrandaki Başlat düğmesine basın. Elektroporasyondan hemen sonra, kültür ortamının reaksiyon hacminin beş katını küvete ekleyin.Şimdi hücreleri yavaşça hazırlanan plakaya aktarın ve plakayı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Daha önce gösterildiği gibi bir ortam değişikliği yaptıktan sonra, hücrelerin 10 mikrolitresini toplayın ve bir hemositometre ile 1: 2'lik bir seyreltmede Türk çözeltisini kullanarak sayın. Transdüksiyon için fibronektin kaplı plakalarda gerekli hücre dozunu yeniden plakalayın ve ayrı olarak, transdübe edilmemiş negatif kontrol hücrelerini plakalayın.Daha sonra lentiviral vektörü her bir kuyucuk içeren hücreye ekleyin ve yaklaşık% 30 transdüksiyon verimliliği elde etmek için hücre başına 20 transdüksiyon birimi dozunu koruyun. Bununla birlikte, deneysel gereksinimlere bağlı olarak lentiviral vektör dozunu ampirik olarak belirleyin. Son olarak, hücreleri altı saat boyunca doku kültürü inkübatörüne geri gönderin.Daha önce açıklandığı gibi bir orta değişiklik gerçekleştirin. C-Kit ile zenginleştirilmiş HSC'lerin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması, CD150-pozitif, CD34-negatif, c-Kit-pozitif, Sca1-pozitif ve soy-negatif olan hücrelerin yaklaşık% 0.2'sini verdi. Dört haftalık HSPC kültüründen sonra, CD201-pozitif, CD150-pozitif, c-Kit-pozitif, Sca1-pozitif ve soy-negatif fraksiyonların yaklaşık% 10 olduğu bulunduGFP eksprese eden bir lentiviral vektör ile transdüksiyonu takiben, GFP-pozitif hücreler yaklaşık% 30 idi.İlk ortam değişikliğinin yapılmasından önceki ilk 24 ila 48 saat içinde yaklaşık% 50 hücre ölümü gözlendi. Bununla birlikte, bir hafta sonra, hücre sayıları, tohumlanan hücre sayısının% 80 ila% 100'üne geri döndü. Taze ve önceden ısıtılmış ortamların kullanıldığı doğru ortam değişiklikleri, bu HSC kültür yönteminin uzun vadeli kararlılığı için kritik öneme sahiptir.Orijinal yöntem 2019 yılında yayınlandığından beri, alan HSC biyolojisini incelemek için farklı şekillerde kullanmaya başlamıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH&#39;lerin)

Biyoloji

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Metabolik Profil Gerçek Zamanlı Analizi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fare Bağırsak Crypt organoid Kültürleri

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...