Name: visualizing early infection sites of rice blast disease (magnaporthe oryzae) on barley (hordeum vulgare) using a basic microscope and a smartphone
Uploaded: 2023-03-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease Magnaporthe oryzae on Barley Hordeum vulgare Using a Basic Microscope and a Smartphone at JoVE.com

Yazarlar, USDA-NIFA ödülü 2016-67013-24816'dan fon sağladığını kabul etmektedir.

1. Deney malzemelerinin hazırlanması
<ol><li>Yulaf ezmesini ince bir toz haline gelene kadar karıştırarak yulaf ezmesi agarını (OMA) hazırlayın. 500 mL ddH2O'ya 25 g yulaf ezmesi tozu ve 15 g agar ekleyin ve ortam döngüsünde otoklav ekleyin (alternatif olarak 20 dakika kaynatın). Ortamı steril 60 mm Petri kaplarına dökün. NOT: V8 agar gibi sporülasyona neden olan diğer ortam türleri bu protokol için kabul edilebilir.</li>
	<li>Plaka M. oryzae filtresi, steril...

<ol>
	<li>Roy, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+barley+blast+caused+by+Magnaporthe+oryzae+pathotype+Triticum+(MoT)+in+Bangladesh.">First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh.</a> Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).</li><li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology.">The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li><li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea.">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li><li>Wilson, R. A., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Under+pressure:+investigating+the+biology+of+plant+infection+by+Magnaporthe+oryzae.">Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).</li><li>Giraldo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+secretion+systems+facilitate+tissue+invasion+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Nature Communications. 4, 1996 (2013).</li><li>Islam, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+wheat+blast+in+Bangladesh+was+caused+by+a+SouthAmerican+lineage+of+Magnaporthe+oryzae.">Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae.</a> BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).</li><li>Langridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Economic+and+Academic+Importance+of+Barley.">Economic and Academic Importance of Barley.</a> The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , 1-10 (2018).</li><li>Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+two+strains+of+Magnaporthe+grisea+with+rice,+goosegrass,+and+weeping+lovegrass.">Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass.</a> Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).</li><li>Gowda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+rice-blast+fungus+Magnaporthe+oryzae+field+isolates+from+southern+India.">Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India.</a> Genomics Data. 5, 284-291 (2015).</li><li>Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+reporters+for+functional+analysis+in+rice+leaves.">Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves.</a> Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).</li><li>Fernandez, J., Wilson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+no+feeding+frenzy?+Mechanisms+of+nutrient+acquisition+and+utilization+during+infection+by+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae.">Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).</li><li>Cooper, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Genetic+Control+of+Reactive+Oxygen+Species+in+Magnaporthe+oryzae+(the+Rice+Blast+Fungus)+through+Development,+Screening,+and+Characterization+of+a+Random+Insert+Mutant+Library.">Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library.</a> University of Delaware. , (2022).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=al.The+plant+infection+test:+Spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea.">al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).</li><li>Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inoculation+method+of+Magnaporthe+grisea+for+cytological+observation+of+the+infection+process+using+intact+leaf+sheaths+of+rice+plants.">A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).</li><li>Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+surface+attachment+in+spores+of+a+plant+pathogenic+fungus.">A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus.</a> Science. 239 (4837), 288-290 (1988).</li><li>Khang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+of+Magnaporthe+oryzae+effectors+into+rice+cells+and+their+subsequent+cell-to-cell+movement.">et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement.</a> The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).</li></ol>

Sprey veya damlacık aşılamaları gibi uyumlu veya uyumsuz bir enfeksiyon yanıtının makroskopik düzeyde bir görselini sağlayan M. oryzae suşlarını test etmek için yaygın olarak kullanılan birçok tahlil ve lezyon boyutlarını ölçmek için derecelendirme sistemlerinin kullanımı13,14 vardır. M. oryzae için bir başka yaygın tahlil, patojenin özel penetrasyon yapısını, apppressorium15'i oluşturma y...

Magnaporthe oryzae, pirinç patlama mantarı, arpa, buğday ve pirinç1 dahil olmak üzere çeşitli tahıl bitkilerini enfekte eder. Bu patojen yıkıcı hastalıklara neden olur ve bu değerli ürünler için dünya çapında bir tehdit oluşturur ve kontrol edilmezse tam ürün kaybına neden olur. Dünyadaki birçok laboratuvar, küresel tehdidi ve bitki-mantar etkileşimleri için mükemmel bir model olarak özellikleri nedeniyle pirinç patlama hastalığına odaklanmaktadır2. Tamamen sıralanmıştır ve enfektif döngüsünün genetiği, özellikle de erken olaylar, 3,4 olarak belirlenmiştir. Yaşam döngüsü, bir yaprak yüzeyinde çimlenen bir sporla başlar ve appressorium adı verilen özel penetrasyon yapısını oluşturur. Appressorium yaprak dokusuna nüfuz eder ve enfeksiyon, sporülasyon sürecini başlatan ve hastalık4'ü yayan lezyonların gelişimi ile devam eder. Bu erken olaylardan herhangi birini önlemek, bu yıkıcı hastalığı büyük ölçüde engelleyecektir. Sonuç olarak, patlama hastalığı ile ilgili en güncel araştırmalar, bir appressoryum oluşturan çimlenmiş konidiadan invaziv hiflerin ve biyotrofik ara yüzey kompleksinin (BIC) gelişimine kadar erken enfeksiyon adımlarına odaklanmıştır5.
M. oryzae çeşitli mahsuller için önemli bir patojen olmasına rağmen, patlama hastalığı üzerine çok sayıda araştırma pirinçte yapılmıştır ve yeni evrimleşmiş suşlar buğday6 için küresel bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır. Pirinç, buğday ve mısırla birlikte nüfusu beslemek için kullanılan ilk üç temel üründen biri iken, arpa hayvan yemi ve bira üretimi açısından dördüncü tahıl tanesidir7. Zanaat birası endüstrisi büyüdükçe, arpanın ekonomik değeri de artar. M. oryzae ve arpanın patlama hastalığını incelemek için bir patosistem olarak kullanılmasının belirgin avantajları vardır. İlk olarak, sadece arpayı enfekte eden M. oryzae suşlarının yanı sıra birden fazla çim türünü enfekte edebilen suşlar da vardır. Örneğin, 4091-5-8 öncelikle sadece arpayı enfekte ederken, Guy11 ve 70-15 hem arpa hem de pirinç8'i enfekte edebilir. Bu suşlar genetik olarak benzerdir ve enfeksiyon süreci karşılaştırılabilir9. İkincisi, standart laboratuvar ve sera koşullarında, pirincin karmaşık gereksinimlerine (özlü sıcaklık kontrolü, yüksek nem, spesifik ışık spektrumları) sahip olmadığı için arpanın yetiştirilmesi daha kolaydır. Arpanın10 göstermediği yaprak yüzeyinin hidrofobikliği nedeniyle pirinçle ilgili görüntüleme zorlukları da vardır.
Bu protokol, çoklu enfeksiyon aşamalarının mikroskobik analizi için arpa yaprağı kılıflarını izole etmek ve etkili bir şekilde kullanmak, ortak laboratuvar malzemeleri ve veri toplamak için bir akıllı telefon kullanmak için basit bir yöntem sunar. Arpa yaprağı kılıf testi için bu yöntem, minimum malzeme gerektirdiği için dünyadaki laboratuvarlar için uyarlanabilir ve yine de patojen ile enfekte ettiği ilk birkaç hücre arasındaki mikroskobik etkileşimin net bir resmini sağlar. Sprey veya damlacık aşılaması gibi patojenite testleri, patojenin lezyon oluşturma yeteneğinin makro bir görünümünü sağlayabilirken, bu tahlil araştırmacının penetrasyon öncesi olaylardan epidermal hücrelerin kolonizasyonuna kadar erken enfeksiyonun belirli adımlarını görselleştirmesine olanak tanır. Ayrıca, araştırmacılar vahşi tip mantar ile enfeksiyonu, virülansta azaltılmış bir mutant ile enfeksiyonla kolayca karşılaştırabilirler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell phone&#160;</td>
			<td>Google&#160;</td>
			<td>Pixel 4A</td>
			<td>Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell phone Microscope adapter</td>
			<td>Vankey</td>
			<td>B01788LT3S</td>
			<td>https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&#38;qid=1662568182&#38;sprefix= 
			vankey+%2Caps%2C63&#38;sr=8-2 
			-spons&#38;psc=1&#38;spLa=ZW5jcnlwd 
			GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR 
			jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 
			9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E 
			M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM 
			DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI 
			md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY 
			WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 
			QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>FM690TC</td>
			<td>40x&#8211;2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal old fashioned rolled oats</td>
			<td>Quaker</td>
			<td>N/A</td>
			<td>https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&#38;linkCode=df0 
			&#38;hvadid=312253390021&#38;hvpos= 
			&#38;hvnetw=g&#38;hvrand=98212627704 
			6839544&#38;hvpone=&#38;hvptwo=&#38;hvq 
			mt=&#38;hvdev=c&#38;hvdvcmdl=&#38;hvlocint 
			=&#38;hvlocphy=9007494&#38;hvtargid 
			=pla-568492637928&#38;psc=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProMix BX</td>
			<td>ProMix</td>
			<td>1038500RG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular coverglass</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS2975245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, microscope</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer&#160;</td>
			<td>OMAX</td>
			<td>A36CALM7</td>
			<td>0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing early infection sites of rice blast disease (magnaporthe oryzae) on barley (hordeum vulgare) using a basic microscope and a smartphone

Bitkilerin ve patojenlerin nasıl etkileşime girdiğini ve bu etkileşimin savunma veya hastalıkla sonuçlanıp sonuçlanmadığını anlamak, bitki sağlığı için daha güçlü ve daha sürdürülebilir stratejiler geliştirmek için gereklidir. Enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında bitki-patojen örneklerini daha etkili bir şekilde görüntüleyen yöntemlerdeki ilerlemeler, pirinç ve mantar patojeni Magnaporthe oryzae arasındaki enfeksiyon ve erken kolonizasyon olaylarının izlenmesinde yararlı olan pirinç yaprağı kılıfı testi gibi araçlar sağlamıştır. Bu hemi-biyotrofik patojen, pirinç ve darı, çavdar, arpa ve daha yakın zamanda buğday dahil olmak üzere ilgili monokotlarda ciddi hastalık kaybına neden olur. Yaprak kılıfı testi, doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, araştırmacıların patojen saldırısı sırasında canlı hücre görüntülemesi yapmalarına veya belirli özellikler için boyanmış sabit örnekler oluşturmalarına olanak tanıyan birkaç kat kalınlığında, optik olarak net bir bitki bölümü verir. Arpa-M. oryzae etkileşimine ilişkin ayrıntılı hücresel araştırmalar, bu tahılın hayvanlar ve insanlar için bir besin kaynağı ve fermente içecekler olarak artan önemine rağmen, pirinç konağının gerisinde kalmıştır. Burada, aşılama sonrası ilk 48 saat boyunca M. oryzae etkileşimlerinin karmaşık çalışmaları için bir arpa yaprağı kılıfı testinin geliştirilmesi bildirilmiştir. Yaprak kılıfı testi, hangi türün çalışıldığına bakılmaksızın, hassastır; Arpa yetiştirme koşullarından yaprak kılıfı elde edilmesine, bitki yaprakları üzerindeki patojenin aşılanmasına, inkübasyonuna ve görüntülenmesine kadar her şeyi kapsayan bir protokoldür. Bu protokol, görüntüleme amacıyla akıllı telefon kadar basit bir şey kullanılarak yüksek verimli tarama için optimize edilebilir.

Bu teknik için ilk iş akışının bir tasviri Şekil 1'de gösterilmiştir. Kılıflar 14 günlük duyarlı "Lacey" arpa bitkilerinden (H. vulgare) toplandı. Konidia, 10 günlük sporlaştırıcı M. oryzae OMA plakalarından, mL başına 5 x 104 sporun nihai konsantrasyonu için steril ddH2O kullanılarak hazırlanan konidiyal bir süspansiyonla toplandı. İnokulum süspansiyonu, steril Petri plakalarına sabitlenen yaprak kılıflarına doğruda...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease Magnaporthe oryzae on Barley Hordeum vulgare Using a Basic Microscope and a Smartphone at JoVE.com

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease Magnaporthe oryzae on Barley Hordeum vulgare Using a Basic Microscope and a Smartphone

Bu, minimum reaktifler ve ortak laboratuvar ekipmanı (temel bir akıllı telefon dahil) kullanan bir arpa yaprağı kılıfı testinin basit bir protokolüdür. Amaç, gelişmiş mikroskopi ekipmanlarına erişimi olmayan laboratuvarlarda patlama hastalığının erken enfeksiyon sürecini görselleştirmektir.

Pirinç Patlaması Hastalığının (Magnaporthe oryzae) Erken Enfeksiyon Bölgelerinin Arpa (Hordeum vulgare) Üzerinde Temel Bir Mikroskop ve Akıllı Telefon Kullanarak Görselleştirilmesi

Understanding how plants and pathogens interact, and whether that interaction culminates in defense or disease, is required to develop stronger and more ...

Protokolümüz, araştırmacıların pahalı ekipman kullanmadan vahşi tip ve genetik mantar mutantlarının erken enfeksiyon adımlarını görselleştirmelerini sağlayan basitleştirilmiş bir yöntemdir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık biyolojik soruları cevaplamak ve mantar mutantlarının daha fazla analiz için hızlı bir şekilde taranması için temel laboratuvar malzemelerinin kullanılmasıdır. Bu tekniğin zor bir kısmı kılıfın tedavisidir.Kılıf, kolayca zarar görebilecek ince bir hücre tabakasıdır, bu nedenle başarılı bir deney için dikkatli kullanım şarttır. Başlamak için, ikinci yaprak aşamasına kadar yetiştirilen arpaları seçin. Steril makas kullanarak, arpa bitkisini toprak çizgisinin hemen üzerinde kesin.Forseps ve neşter kullanarak, uzunlamasına açık olan ilk yaprağın kılıfını dikkatlice kesin. Forsepsleri kullanarak, ikinci yaprağın tabanından çıkarın. Bir neşter kullanarak, ilk yaprağın çoğunu kılıftan uzaklaştırın ve montaj için yaprak dokusunun sadece 0,5 inçini bırakın.İlk yaprağı, plakanın içindeki nemi korumak için ıslak bir kağıt havlu içeren steril bir 60 milimetre Petri kabına yerleştirin. Yaprak dokusunu Petri kabının dibine bantlayın. Dokuz ila 12 günlük bir Magnaporthe oryzae kültür plakası seçin ve üzerine 0,5 ila iki mililitre steril su ekleyin.Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, ekli konidiayı serbest bırakmak için miseli yavaşça kazıyın. Konidiyal süspansiyondan büyük miselyum parçalarını filtrelemek için konidiyal süspansiyonu küçük bir parça peynir bezi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin. Gerekirse, spor konsantrasyonunu steril suyla mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü sporlara kadar seyreltin, çünkü konsantrasyonun çok yüksek olması bireysel enfeksiyon bölgelerinin görüntülenmesini zorlaştırır.Kılıf boyutuna bağlı olarak, haddelenmiş yaprak kılıfının içindeki konidiyal süspansiyonun 25 ila 50 mikrolitresini dikkatlice pipetin. Daha sonra, dört veya beş adet 500 mililitrelik beheri çift damıtılmış suyla doldurun ve buharlaşana kadar ısıtın. Petri kabının kapağını, tabağın içindeki nemi hapsetmek için buharda pişirilen beherlerden birinin üzerinde tutun.Enfekte yaprak kılıf plakalarını istifleyin ve sporların çimlenmesi için nemli, nemli bir ortam yarattığı için kalan sıcak beherlerle çevreleyin. Bu kurulumu düz renkli bir kauçuk veya plastik kutu ile kaplayarak ve 48 saat boyunca veya görüntüleme için istenen zaman noktasında rahatsız edilmeden bırakarak ışıktan koruyun. Taze seyreltilmiş %45 asetik asit ve %0,1 tripan mavisini karıştırarak lekeyi hazırlayın.Boya çözeltisinin bir mililitresini mikrosantrifüj tüplerine aliquot. Bir neşter kullanarak, yaprak kılıfını banttan dikkatlice kesin. Forseps kullanarak, kılıfı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve boya çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun.Boyanın yaprağa nüfuz etmesi için tüplerin 40 santigrat derecelik bir ısı bloğunda veya su banyosunda iki saat beklemesine izin verin. Daha sonra, ekstra boyayı çıkarmak için yaprak kılıflarını% 60 taze gliserol içinde üç kez dikkatlice durulayın. Kılıfı slaytlara monte etmeye hazır olana kadar gliserol içinde tutun.Kılıfı temiz bir cam slayda yerleştirin ve birkaç damla% 60 gliserol ekleyin. Diseksiyon mikroskobu ve iki çift forseps kullanarak, aşılanmış merkezi yukarı bakacak şekilde bırakarak kılıfı dikkatlice açın. Kılıfı forseps ile açık tutarak, kılıfın kıvrılmasını ve enfeksiyon bölgesini tıkamasını önlemek için kapak kaymasını üstüne yerleştirin.Uzun süreli depolama veya bant kısa süreli depolama için oje kullanarak kapak fişini kapatın. Slaytları bileşik ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Mikroskopa bir cep telefonu adaptörü takarak akıllı telefonla temel görüntüleri çekin.Android cihazlar için, kamera uygulaması ayarlarını yanıp sönecek şekilde ayarlayın, üst çekimi devre dışı bırakın, parlaklık ve gölgelerin otomatik olarak ayarlanmasını devre dışı bırakın ve fotoğraf çözünürlüğünü tam olarak ayarlayın. Cep telefonunu monte ettikten sonra, verileri elde etmek için istenen bir hedefe sahip bir ölçek mikrometresinin görüntüsünü alın. Telefonun yakınlaştırmasını 2,5 x'e ayarlayın ve tutarlı bir piksel boyutunu korumak için tutarlı tutun.Kılıfın merkezi, en büyük spor konsantrasyonuna ev sahipliği yapar ve appressoria'yı enfekte eder. Bu nedenle, istatistiksel analiz için önemli sayılar elde etmek için her kılıfın dokuz ila 12 görüntüsünü hedefleyin. Kılıfın enfeksiyon bölgeleri, tripan mavisi ile boyandıktan sonra bir akıllı telefon ve akıllı telefon mikroskop adaptörü kullanılarak görüntülendi.Boyama işlemindeki ısı ve asetik asit, yaprak dokusunu nazikçe yumuşatır. % 60 gliserol içindeki boyama sonrası durulamalar sadece fazla lekeyi çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda yaprağın neden olduğu ışık saçılımını azaltmaya ve görüntü kalitesini iyileştirmeye yardımcı olur. Boyama protokolünden sapmalar, burada gösterildiği gibi optimal olmayan sonuçlara neden olabilir.4091 vahşi tip ile enfekte olmuş arpa, yaprak kılıf dokusu içinde enfekte olmuş hiflerin varlığı ile tanımlanan başarılı bir şekilde enfekte olmuş hücreler üretti. Mutant J99A enfeksiyonu durumunda, appressoria ve penetrasyon mandallarının başarılı gelişimi fark edildi, ancak invaziv hifler üretmedi. Enfeksiyona dayalı analizler için zamanlama önemlidir.Uygun şekilde yaşlandırılmış bitkiler ve mantar sporları başarı için gereklidir. Bu çalışmada enfeksiyon yapılarının varlığına veya yokluğuna baktık. Ek deneyler, enfeksiyon yapısının fenotipi ve istilacı hiflerin fenotipi ile ilgili soruları cevaplayabilir.Metodolojimiz yeni değil, daha karmaşık, pahalı bir deneyin basitleştirilmiş, erişilebilir bir versiyonudur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Early Infection Sites of Rice Blast Disease (Magnaporthe oryzae) on Barley (Hordeum vulgare) Using a Basic Microscope and a Smartphone

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Gelişim Biyolojisi

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...