Name: gene expression analyses in human follicles
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00
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この研究は、Excellence of Science(EOS)助成金(ID:30443682)によってサポートされました。ベルギー国立科学財団(FNRS)の准研究員。

このプロジェクトは、エラスメ病院倫理委員会(ベルギー、ブリュッセル)によって承認されました。このプロトコルに含まれる患者は、2000年に化学療法曝露前に生殖能力温存のための卵巣組織凍結保存(OTC)を受けました。患者は、保管期間の終わりに残りの凍結組織を研究に寄付するための書面による同意に署名しました。
1.凍結保存された卵巣組織の解凍...

<ol>
	<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+follicular+development:+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation.">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li><li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction.">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li><li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization.">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li><li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary.">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).</li><li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue.">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li><li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection.">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417 (2011).</li><li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival.">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).</li><li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro.">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary.">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li><li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth.">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li><li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation,+homogenization,+and+serial+filtration.">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).</li><li>Schallmoser, A., Einenkel, R., F&#228;rber, C., S&#228;nger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+(IVG)+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions.">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth.">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li><li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure:+Alternatives,+perspectives+and+feasibility.">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li><li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation:+Case+report.">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation.">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li><li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor.">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li><li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm.">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li><li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients:+A+cost-effectiveness+study.">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li><li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue:+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation.">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li><li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ovarian+follicle+growth:+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables.">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li><li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles.">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li><li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue.">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li><li>Dong, F. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles.">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li><li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation:+a+comparison+of+different+isolation+protocols.">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li><li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours.">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li><li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles.">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles.">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li><li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH:+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting.">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li><li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices.">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).</li></ol>

卵巣組織の凍結保存は、がん患者の生殖能力を維持するための有望なアプローチです。診療所では、融解した皮質組織が寛解後に患者に移植され、卵巣機能と生殖能力の再開が可能になります19,20。臨床使用に加えて、卵胞形成を調節するメカニズムを研究するために、保存期間の終わりに研究のために残留卵巣断片を提供することもできます。さ...

卵巣は、皮質内の卵胞および間質を含む機能的および構造的単位からなる複雑な器官である。卵胞形成は、卵胞の活性化、成長、および原始静止状態から受精し、初期の胚発生をサポートすることができる成熟卵胞への成熟までのプロセスであり、研究1で広く研究されています。この現象を引き起こすメカニズムを解明することで、女性の不妊治療を改善する可能性があります2。固定されたヒト組織の分析により、卵巣の機能単位内のタンパク質発現と遺伝子局在の評価が可能になります3,4。ただし、卵胞内の遺伝子発現レベルを正確に評価するには、卵胞を周囲の皮質から分離するための特定の技術が必要です。したがって、以前の研究では、卵巣の機能単位から直接遺伝子発現を分析できるように卵胞分離技術が開発されました5。酵素消化および/または機械的単離、ならびにレーザー捕捉マイクロダイセクションなど、組織片内の卵胞の分離を可能にするさまざまなアプローチが開発されています6、7、8、9。卵胞単離は、ヒトまたは動物の卵巣組織のいずれかで、発生のすべての段階で卵胞の遺伝子発現プロファイルを評価するために広く使用されています10、11、12。ただし、最適な分離手順は、密な皮質内の卵胞の脆弱な構造を考慮に入れるべきであり、したがって、損傷を避けるために注意して実行する必要があります7。この原稿は、Woodruffの研究室によって記述されたプロトコルから適応された、遺伝子発現分析を実行するために凍結融解卵巣皮質からヒト卵胞を分離する手順を説明しています13。
凍結ヒト組織からの卵巣卵胞単離の最初のステップは解凍手順です。このプロセスは、前述のように、凍結保存された卵巣組織の移植に使用される臨床プロトコルに基づいて実行されます14、15。このプロセスは、培地の濃度を下げて卵巣皮質をすすぐことにより、凍結保護剤を除去することを目的としています。次に、卵胞を回収するために酵素的および機械的単離の前に組織を断片化する。異なる段階の卵胞は、関心のあるものを分離するために、高倍率および高品質の光学系を備えた実体顕微鏡を使用して区別することができる。単離された各卵胞は、顕微鏡に統合された定規を使用して測定され、卵胞は、原始卵胞(30 μm)、一次卵胞(60 μm)、二次卵胞(120-200 μm)、および胞状卵胞(>200 μm)の発達段階に応じてプールできます16。卵胞の形態に従ってさらなる分類を行うことができます:原始卵胞は1層の平らな顆粒膜細胞(GC)を有し、一次卵胞は1層の直方体GCを有し、二次卵胞は少なくとも2層の直方体GCを有し、そしてGC間の空洞の存在は胞状段階を特徴付ける。目的の卵胞が選択されると、RNA抽出が行われます。RNAの量と質は、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)の前に評価されます(図1)。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mm gridded Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>version B.02.08.SI648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-wells plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells plate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>&#160;EKX5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent total RNA 6000 pico kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4527-10kU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoScript reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA</td>
			<td>CAF DCF&#160;</td>
			<td>LC4403-41-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz-15</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11415-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A + bicarbonate + Hepes</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>12330-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary RI EZ-Tips 200 &#181;m</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-2200/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary RI EZ-Tips 75 &#181;m</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-2075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c operating software</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>version 1.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerTrack SYBR green master mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A46109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: GDF9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: HPRT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: Kit Ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time qPCR Quantstudio 3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous-micro total RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycine sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Forma Series II&#160; water-jacketed CO2&#160;incubators</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Stadie-Riggs tissue slicer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6727C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analyses in human follicles

卵巣は、異なる細胞型で構成される不均一な器官です。卵胞形成中に起こる分子機構を研究するために、タンパク質の局在化および遺伝子発現を固定組織上で行うことができる。しかし、ヒトの卵胞における遺伝子発現レベルを適切に評価するためには、この複雑で繊細な構造を分離する必要があります。したがって、ウッドラフの研究室によって以前に記述された適応プロトコルは、卵胞(卵母細胞および顆粒膜細胞)を周囲の環境から分離するために開発されました。卵巣皮質組織は、最初に手動で処理され、組織スライサーと組織チョッパーの2つのツールを使用して小さな断片が得られます。次に、組織を0.2%コラゲナーゼおよび0.02%DNaseで少なくとも40分間酵素消化します。この消化ステップは、37°Cおよび5%CO2 で行われ、10分ごとに培地の機械的ピペッティングを伴う。インキュベーション後、単離された卵胞は、顕微鏡倍率下で較正されたマイクロキャピラリーピペットを使用して手動で収集されます。卵胞がまだ組織片に存在する場合、手順は手動の微小解剖で完了します。卵胞は培養液中の氷上で収集され、リン酸緩衝生理食塩水の液滴で2回すすがれます。この消化手順は、卵胞の劣化を避けるために慎重に管理する必要があります。卵胞の構造が損なわれているように見えるか、最大90分後に、10%ウシ胎児血清を含む4°Cブロッキング溶液で反応を停止します。リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)のためのRNA抽出後に適切な量の総RNAを得るために、最低20個の単離された卵胞(75μm未満のサイズ)を収集する必要があります。抽出後、20個の卵胞からの総RNAの定量は5 ng / μLの平均値に達します。次に、全RNAをcDNAにレトロ転写し、RT-qPCRを使用して目的の遺伝子をさらに分析します。

この単離手順を使用して、実験者は間質環境から卵胞を回収し、特定の遺伝子発現分析を行うことができます。卵胞の大きさと形態に基づいて、卵胞形成のさまざまな段階を区別することが可能です。実験者は、適合したマイクロキャピラリーピペットを使用して、サイズに応じて目的の卵胞を選択できます。最大75μmのマイクロキャピラリーを使用することにより、原始卵胞と一次卵胞を?...

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Gene Expression Analyses in Human Follicles

ここでは、凍結融解皮質組織からヒト卵巣卵胞を単離して遺伝子発現解析を行う方法を概説するプロトコルについて説明します。

ヒト卵胞の遺伝子発現解析

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

このプロトコルは、これらの生殖細胞の遺伝子発現分析を評価するために、周囲の間質細胞から卵巣卵胞を分離する効率的な方法を説明しています。この技術は、制御された酵素的および機械的単離を使用して、卵胞の完全性を維持しながら卵胞の回収を可能にします。このプロトコルに従って、研究者はこれらの細胞からの特定の遺伝子発現を評価することができます。この手法は、卵巣機能に影響を与える疾患に関連する、または毒性物質への曝露後の卵胞における遺伝子発現の欠損をさらに理解するために使用できます。最初のウェルに5ミリリットルの凍結保護剤溶液を加え、次の4つのウェルに5ミリリットルのLeibovitz 15培地を添加して、次の4つのウェルに凍結保護剤の濃度を下げて、6ウェルプレートの準備を開始します。安全規則に従って、卵巣皮質断片を含むバイアルを液体窒素から取り除きます。室温またはRTで30秒後、バイアルを二重蒸留水に2分間浸します。垂直フード内で、卵巣皮質断片バイアルを静かに攪拌して開き、内容物を氷上に置いた6ウェルプレートの最初のウェルに移します。次いで、第1のウェルにおける卵巣皮質断片を、5ミリリットルのLeibovitz 15培地中の減少濃度の凍結保護剤を含む6ウェルプレートの各ウェルに連続して移す。各培地中の組織を5分間穏やかに攪拌します。卵胞を単離するには、解凍した卵巣組織を、10ミリリットルの解剖培地、1ミリリットルあたり30マイクログラムのペニシリンG、および1ミリリットルあたり50マイクログラムのストレプトマイシンで満たされた2ミリメートルのグリッド付きペトリ皿に移します。必要に応じて、メスで組織サイズを調整します。組織スライサーの3つの部分を積み上げ、2つのブロックの間に卵巣片を配置します。ブレードを使用して断片を半分に切断し、ブロックをスライドさせて、厚さ0.5ミリメートルの2つの断片を得ます。ティッシュチョッパーを使用して組織を切断し、小さな断片を取得します。必要に応じて、組織が粉砕されるまでメスで残りの部分を手動で切断します。組織が粉砕されたら、断片化した組織を7ミリリットルの消化媒体で満たされたグリッド状のペトリ皿に移してから、5%二酸化炭素と摂氏37度のインキュベーターに皿を置きます。10分ごとにインキュベーターからペトリ皿を取り出します。消化媒体を1ミリリットルのピペットで上下にピペッティングして組織を洗い流します。消化培地中で45分間インキュベートした後、ディッシュを5〜6.3倍の倍率範囲の実体顕微鏡下に置き、マイクロキャピラリーピペットを使用して卵胞を回収します。目的の卵胞を選択し、マウスピペットで吸い上げて分離します。卵胞が皮質の一部に詰まったままの場合は、注射器の先端で皮質をはぎ取り、間質から卵胞を解放することにより、2つの27ゲージ注射器でそれらを機械的に分離します。マイクロキャピラリーを使用して、単離した卵胞を、500マイクロリットルの油培養液で覆われた15マイクロリットルの較正済み培養培地を含む4ウェルプレートに移します。1〜10個の卵胞を移した後、500マイクロリットルの油培養液で覆った15マイクロリットルのPBSを2滴ずつ5秒間2回すすぎます。マウスピペットを使用して、空のチューブに最小限のPBSで20個の卵胞を集め、チューブを氷の上に置きます。消化培地中で90分間インキュベートした後、コールドブロッキング溶液を加えて酵素反応を停止します。ケミカルフードの下で、RNA抽出キットに付属の100マイクロリットルの溶解溶液に単離された卵胞を懸濁します。単離された卵胞を毎分2500 RPMでボルテックスして構造を破壊し、50マイクロリットルの100%エタノールをチューブに加えます。そして、チューブを高速で短時間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブの全体積をカラムと収集チューブを含むマイクロフィルターカートリッジアセンブリに移します。そして、アセンブリを摂氏4度で16、363gで10秒間遠心分離する。チューブを10秒間遠心分離する前に、キットに付属の180マイクロリットルの洗浄液1でカラムを洗浄します。180マイクロリットルの洗浄液2、3をカラムに2回洗浄した後、最後にもう一度チューブを遠心分離してフィルターを乾燥させ、新しい収集チューブをカートリッジの下に置きます。核酸の溶出を実行するには、まず8マイクロリットルの摂氏75度溶出溶液をフィルターアセンブリに追加します。1分後、アセンブリを30秒間遠心分離します。7マイクロリットルの溶出溶液でこの手順を繰り返します。完了したら、2つの国際ユニットDNaseおよびDNaseバッファーをチューブに加え、チューブを摂氏37度で20分間インキュベートします。10 x 10 DNase不活化試薬で室温で2分間酵素活性をブロックします。次に、チューブを摂氏4度で16, 363gで1.5分間遠心分離し、RNAを含む懸濁液を新しいチューブに移します。分光光度計を使用して、サンプル中のRNAの量を評価します。ブランクとして1マイクロリットルの溶出溶液を使用し、単離された卵胞から抽出したRNAの1マイクロリットルの溶液を使用します。RNA純度について、260/280の比率が約2.0であるかどうかを確認します。また、サンプルを摂氏マイナス80度で保存するか、直接レトロ転写してRT-qPCRを実行します。 このプロトコルを使用して、同じ患者からの4x2x1ミリメートルの2つの均質化された卵巣断片を処理して、卵胞を分離しました。RNA定量により、75マイクロメートル未満の卵胞から全RNA1マイクロリットルあたり4.8ナノグラムが純度比1.89で抽出されたことが明らかになりました。200マイクロメートル未満の卵胞から、全RNAのマイクロリットルあたり10.5ナノグラムを1.74の純度比で抽出した。RNAインテグリティナンバー(RIN)の値は、チューブ1と2でそれぞれ7.1と7.9であり、サンプルからのRNAの品質を検証しました。リアルタイムPCRシステムで標準サイクルを実行した後、得られたサイクル閾値(CT)は、HPRTで30.87および29.56、キットリガンドで33.5および31.77、GDF9で30.71および30.57でした。組織の酵素消化は重要なポイントです。実験者は、必要に応じて卵胞を停止することにより、反応中の卵胞の完全性を継続的に評価および確認する必要があります。遺伝子発現解析に加えて、単離された卵胞は、卵胞のin vitro培養や人工卵巣など、がん患者の生殖能力を維持するための実験システムを開発するために使用されます。分離技術には、多数の無傷の卵胞を回収するための学習曲線が必要でした。研究者は、消化前に組織が十分に粉砕されていることを確認することをお勧めします。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

文化と共培養マウスの卵巣と卵胞

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

発生生物学

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...