Name: gene expression analyses in human follicles
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Excelência da Ciência (EOS) (ID: 30443682). I.D. é pesquisador associado do Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Erasme (Bruxelas, Bélgica). A paciente incluída neste protocolo foi submetida à criopreservação de tecido ovariano (COT) para preservação da fertilidade antes da exposição à quimioterapia em 2000. A paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido para doação de seu tecido residual congelado para pesquisa ao final do período de armazenamento.
1. Descongelamento do tecido ovariano criopreservado</strong...

<ol>
	<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+follicular+development:+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation.">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li><li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction.">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li><li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization.">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li><li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary.">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).</li><li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue.">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li><li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection.">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417 (2011).</li><li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival.">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).</li><li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro.">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary.">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li><li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth.">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li><li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation,+homogenization,+and+serial+filtration.">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).</li><li>Schallmoser, A., Einenkel, R., F&#228;rber, C., S&#228;nger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+(IVG)+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions.">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth.">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li><li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure:+Alternatives,+perspectives+and+feasibility.">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li><li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation:+Case+report.">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human:+A+model+from+preliminary+results.">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li><li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation.">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li><li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor.">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li><li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm.">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li><li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients:+A+cost-effectiveness+study.">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li><li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue:+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation.">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li><li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ovarian+follicle+growth:+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables.">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li><li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles.">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li><li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue.">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li><li>Dong, F. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles.">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li><li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation:+a+comparison+of+different+isolation+protocols.">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li><li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours.">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li><li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles.">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li><li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system.">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li><li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles.">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li><li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH:+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting.">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li><li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices.">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).</li></ol>

A criopreservação do tecido ovariano é uma abordagem promissora para a preservação da fertilidade de pacientes com câncer. Na clínica, o tecido cortical descongelado é enxertado de volta na paciente após a remissão, permitindo a retomada da função ovariana e da fertilidade19,20. Além do uso clínico, fragmentos ovarianos residuais também podem ser doados para pesquisa ao final do período de armazenamento para estudar os mecanismos reguladores da fo...

O ovário é um órgão complexo composto por unidades funcionais e estruturais, incluindo os folículos dentro do córtex e o estroma. A foliculogênese, processo de ativação, crescimento e maturação dos folículos de um estado quiescente primordial para um folículo maduro capaz de ser fecundado e suportar o desenvolvimento embrionário inicial, é amplamente estudada empesquisa1. Desvendar os mecanismos que impulsionam esse fenômeno poderia melhorar o cuidado da fertilidade para as mulheres2. Análises em tecido humano fixado permitem avaliar a expressão proteica e a localização gênica dentro das unidades funcionais do ovário 3,4. No entanto, técnicas específicas são necessárias para dissociar os folículos do córtex circundante para avaliar com precisão os níveis de expressão gênica dentro dos folículos ovarianos. Assim, em estudo anterior, uma técnica de isolamento de folículos foi desenvolvida para permitir a análise da expressão gênica diretamente da unidade funcional doovário5. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas, como digestão enzimática e/ou isolamento mecânico, bem como microdissecção por captura a laser, que permitem o isolamento do folículo dentro de um pedaço de tecido 6,7,8,9. O isolamento de folículos é amplamente utilizado, seja com tecido ovariano humano ou animal, para avaliar o perfil de expressão gênica de folículos em todas as fases do desenvolvimento10,11,12. No entanto, um procedimento de isolamento ideal deve levar em conta a frágil estrutura do folículo dentro do córtex denso e, portanto, deve ser realizado com cuidado para evitar qualquer dano7. Este manuscrito descreve um procedimento, adaptado de um protocolo descrito pelo laboratório de Woodruff, para isolar folículos humanos do córtex ovariano congelado descongelado para realizar análises de expressão gênica13.
O primeiro passo do isolamento do folículo ovariano do tecido humano congelado é o procedimento de descongelamento. Esse processo é realizado com base no protocolo clínico utilizado para a enxertia de tecido ovariano criopreservado, conforme descrito anteriormente14,15. O processo visa remover os agentes crioprotetores enxaguando o córtex ovariano em concentrações decrescentes do meio. Em seguida, o tecido é fragmentado antes do isolamento enzimático e mecânico para recuperação dos folículos. Folículos em diferentes estágios podem ser distinguidos usando um estereomicroscópio com alta magnificação e óptica de boa qualidade, a fim de isolar os de interesse. Cada folículo isolado é medido usando uma régua integrada ao microscópio, e os folículos podem ser agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento: folículos primordiais (30 μm), folículos primários (60 μm), folículos secundários (120-200 μm) e folículos antrais (>200 μm)16. Uma classificação posterior pode ser realizada de acordo com a morfologia dos folículos: os folículos primordiais têm uma camada de células da granulosa (GCs) achatadas, os folículos primários têm uma camada de GCs cuboidais, os folículos secundários têm pelo menos duas camadas de GCs cuboidais e a presença de uma cavidade entre os GCs caracteriza o estágio antral. Quando os folículos de interesse são selecionados, a extração de RNA é realizada. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas antes da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mm gridded Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Expert software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>version B.02.08.SI648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-wells plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-wells plate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>&#160;EKX5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent total RNA 6000 pico kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4527-10kU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoScript reverse transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSA</td>
			<td>CAF DCF&#160;</td>
			<td>LC4403-41-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz-15</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11415-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A + bicarbonate + Hepes</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>12330-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary RI EZ-Tips 200 &#181;m</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-2200/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcapillary RI EZ-Tips 75 &#181;m</td>
			<td>CooperSurgical</td>
			<td>7-72-2075/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c operating software</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>version 1.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>2000/2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin G</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerTrack SYBR green master mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A46109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: GDF9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: HPRT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: Kit Ligand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time qPCR Quantstudio 3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A33779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAqueous-micro total RNA isolation kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenium</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycine sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Forma Series II&#160; water-jacketed CO2&#160;incubators</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas Stadie-Riggs tissue slicer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>6727C10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analyses in human follicles

O ovário é um órgão heterogêneo composto por diferentes tipos celulares. Para estudar os mecanismos moleculares que ocorrem durante a foliculogênese, a localização de proteínas e a expressão gênica podem ser realizadas no tecido fixo. No entanto, para avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica em um folículo humano, essa estrutura complexa e delicada deve ser isolada. Assim, um protocolo adaptado descrito anteriormente pelo laboratório de Woodruff foi desenvolvido para separar os folículos (o ovócito e as células da granulosa) de seu ambiente circundante. O tecido cortical ovariano é primeiramente processado manualmente para obter pequenos fragmentos usando duas ferramentas: um fatiador de tecido e um picador de tecido. O tecido é então digerido enzimaticamente com colagenase a 0,2% e DNase a 0,02% por pelo menos 40 min. Esta etapa de digestão é realizada a 37 °C e 5% CO2 e é acompanhada por pipetagem mecânica do meio a cada 10 min. Após a incubação, os folículos isolados são coletados manualmente usando uma pipeta microcapilar calibrada sob magnificação microscópica. Se os folículos ainda estiverem presentes nos pedaços de tecido, o procedimento é completado com microdissecção manual. Os folículos são coletados em gelo em meio de cultura e duas vezes enxaguados em gotículas de solução salina tamponada com fosfato. Este procedimento de digestão deve ser cuidadosamente controlado para evitar a deterioração dos folículos. Assim que a estrutura dos folículos parece estar comprometida ou após um máximo de 90 minutos, a reação é interrompida com uma solução de bloqueio a 4 °C contendo 10% de soro fetal bovino. Um mínimo de 20 folículos isolados (tamanho inferior a 75 μm) deve ser coletado para obter uma quantidade adequada de RNA total após a extração de RNA para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Após a extração, a quantificação do RNA total de 20 folículos atinge um valor médio de 5 ng/μL. O RNA total é então retrotranscrito em cDNA, e os genes de interesse são posteriormente analisados usando RT-qPCR.

Usando este procedimento de isolamento, o experimentador pode recuperar folículos do ambiente estromal para realizar análises específicas de expressão gênica. Com base no tamanho e morfologia dos folículos, é possível diferenciar os diferentes estágios da foliculogênese. O experimentador pode selecionar folículos de interesse de acordo com seu tamanho usando uma pipeta microcapilar adaptada. Usando um microcapilar de no máximo 75 μm, é possível discriminar folículos primordiais e primários de folículos ...

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Gene Expression Analyses in Human Follicles

Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.

Análise da Expressão Gênica em Folículos Humanos

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Este protocolo descreve um método eficiente para isolar folículos ovarianos das células do estroma circundante para avaliar análises de expressão gênica nessas células germinativas. Esta técnica, utilizando isolamentos enzimáticos e mecânicos controlados, permite a recuperação dos folículos mantendo sua integridade. Seguindo esse protocolo, o pesquisador pode avaliar expressões gênicas específicas dessas células.A técnica poderia ser usada para entender melhor o déficit de expressão gênica nos folículos relacionado a doenças que afetam a função ovariana ou após exposição a agentes tóxicos. Comece a preparar uma placa de seis poços adicionando cinco mililitros de solução crioprotetora ao primeiro poço e cinco mililitros de meio Leibovitz 15 com concentrações decrescentes de crioprotetor aos próximos quatro poços. Remova um frasco para injetáveis contendo um fragmento cortical ovariano do azoto líquido, em conformidade com as regras de segurança.Após 30 segundos à temperatura ambiente, ou RT, mergulhe o frasco para injetáveis em água bidestilada durante dois minutos. Dentro de um capuz vertical, agite suavemente e abra o frasco de fragmento cortical ovariano antes de transferir o conteúdo para o primeiro poço da placa de seis poços colocada no gelo. Em seguida, transferir o fragmento cortical ovariano no primeiro poço sucessivamente para cada poço da placa de seis poços contendo concentrações decrescentes de crioprotetor em cinco mililitros de meio Leibovitz 15.Agite suavemente o tecido em cada meio durante cinco minutos. Para o isolamento dos folículos, transfira o tecido ovariano descongelado para uma placa de Petri quadriculada de dois milímetros preenchida com 10 mililitros de meio de dissecção, 30 microgramas por mililitro de penicilina G e 50 microgramas por mililitro de estreptomicina. Ajuste o tamanho do tecido com o bisturi, se necessário.Empilhar os três pedaços do fatiador de tecido e colocar o fragmento ovariano entre os dois blocos. Corte o fragmento ao meio usando uma lâmina, deslizando através dos blocos para obter dois fragmentos de 0,5 milímetro de espessura. Corte o tecido usando o cortador de tecido para obter os pedaços menores.Se necessário, corte as peças restantes manualmente com o bisturi até que o tecido seja esmagado. Uma vez que o tecido é esmagado, transfira o tecido fragmentado para uma placa de Petri quadriculada cheia com sete mililitros de meio de digestão antes de colocar a placa na incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Retire a placa de Petri da incubadora a cada 10 minutos.Lave o tecido pipetando o meio de digestão para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Após 45 minutos de incubação no meio de digestão, colocar a placa sob um estereomicroscópio com amplitude de cinco a 6,3 vezes e recuperar os folículos usando uma pipeta microcapilar. Selecione os folículos de interesse e isole-os sugando-os com uma pipeta bucal.Se os folículos permanecerem presos em um pedaço do córtex, isole-os mecanicamente com duas seringas de calibre 27, arrancando o córtex com a ponta das seringas e liberando folículos do estroma. Usando o microcapilar, transferir os folículos isolados para uma placa de quatro poços contendo 15 microlitros do meio de cultura calibrado coberto por 500 microlitros de cultura de óleo. Após transferir de um a 10 folículos, enxágue-os duas vezes em duas gotas de 15 microlitros de PBS cobertas com 500 microlitros de cultura de óleo por cinco segundos cada.Usando a pipeta bucal, colete 20 folículos com PBS mínimo em um tubo vazio e mantenha o tubo no gelo. Após 90 minutos de incubação no meio de digestão, pare a reação enzimática adicionando uma solução de bloqueio a frio. Sob a capa química, suspender os folículos isolados em 100 microlitros da solução de lise fornecida com o Kit de Extração de RNA.Vórtice os folículos isolados a 2500 RPM por minuto para quebrar sua estrutura e, em seguida, adicione 50 microlitros de etanol a 100% ao tubo. E brevemente vórtice o tubo em alta velocidade. Após o vórtice, transfira o volume total do tubo para um conjunto de cartuchos de microfiltro, composto por uma coluna e um tubo de coleta.E centrifugar o conjunto por 10 segundos a 16, 363g a quatro graus Celsius. Lave a coluna com 180 microlitros da Solução de Lavagem 1 fornecida com o kit antes de centrifugar o tubo por 10 segundos. Depois de dar duas lavagens de 180 microlitros de Wash Solution 2, 3 à coluna, seque o filtro centrifugando o tubo uma última vez e coloque um novo tubo de coleta sob o cartucho.Para realizar a eluição dos ácidos nucleicos, primeiro adicione oito microlitros de solução de eluição de 75 graus Celsius ao conjunto do filtro. Após um minuto, centrifugar o conjunto por 30 segundos. Repita este passo com sete microlitros de Solução de Eluição .Uma vez feito, adicione duas unidades internacionais DNase e DNase tampão ao tubo e incube o tubo por 20 minutos a 37 graus Celsius. Bloquear a atividade enzimática com um por 10 reagente de inativação da DNase por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar o tubo por 1,5 minutos a 16, 363g a quatro graus Celsius e transferir a suspensão contendo o RNA para um novo tubo.Usando um espectrofotômetro, avaliar a quantidade de RNA na amostra. Use uma solução de eluição de microlitro como um branco e uma solução de microlitro de RNA extraído de folículos isolados. Verifique se a relação 260/280 está em torno de 2,0 para a pureza do RNA.E armazenar a amostra a menos 80 graus Celsius ou retrotranscrevê-la diretamente para realizar RT-qPCR. Utilizando esse protocolo, os dois fragmentos ovarianos homogeneizados de 4x2x1 milímetro da mesma paciente foram processados para isolar os folículos. A quantificação do RNA revelou que 4,8 nanogramas por microlitro de RNA total foram extraídos de folículos com menos de 75 micrômetros de tamanho com uma razão de pureza de 1,89.Dos folículos de menos de 200 micrômetros, foram extraídos 10,5 nanogramas por microlitro de RNA total, com uma razão de pureza de 1,74. Os valores do número de integridade do RNA, ou NIR, foram 7,1 e 7,9 nos tubos um e dois, respectivamente, validando a qualidade do RNA de nossas amostras. Após a execução de um ciclo padrão em um sistema de PCR em tempo real, os limiares de ciclo, ou CT, obtidos foram 30,87 e 29,56 para HPRT, 33,5 e 31,77 para kit ligante e 30,71 e 30,57 para GDF9.A digestão enzimática do tecido é um ponto crítico. O experimentador tem que avaliar continuamente e garantir a integridade do folículo durante a reação, interrompendo-a quando necessário. Além das análises de expressão gênica, folículos isolados são usados para desenvolver sistemas experimentais para preservar a fertilidade de pacientes com câncer, como cultura de folículos in vitro ou ovário artificial.A técnica de isolamento exigiu uma curva de aprendizado para recuperar um grande número de folículos intactos. Os pesquisadores são aconselhados a garantir que o tecido esteja bem quebrado antes da digestão.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Biologia do Desenvolvimento

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Organotípicas Co-cultura Modelo de Apoio medular Thymic Epithelial proliferação, diferenciação e Expression Promiscuous Gene

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Alongamento das Beads em Desenvolvimento de frango Limbs embrião para Identificar caminhos da transdução de sinal que afeta Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Cell Lineage Analyses and Gene Function Studies Using Twin-spot MARCM

Análises celular linhagem e estudos da função de genes utilizando marcm Twin-ponto

Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) is a positive mosaic labeling system that has been widely applied in Drosophila neurobiological ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Análises histológicas de lesão hepática alcoólica aguda em peixe-zebra

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Crescimento do folículo pré-antral do Mouse sob microgravidade simulado

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...